LNP共递送双mRNA原位生成CAR-M治疗肝细胞癌，揭示蛋白冠各成分对LNP细胞嗜性的影响

编译：Vergil

排版：三姐夫

巨噬细胞疗法作为一种新兴的细胞疗法，能够通过巨噬细胞的免疫调节和抗肿瘤活性来治疗疾病，较CAR-T疗法在实体瘤治疗方面表现出更好的治疗前景。伴随着宾夕法尼亚大学开展的CAR-M临床前研究和Carisma Therapeutics公司将全球第一个CAR-M产品推向临床I期并获得FDA快速通道资格，CAR-M技术逐渐进入人们视野。然而，体外制备CAR-M同样与CAR-T疗法有着相似的难题，需要克服大规模制备中较长生产周期及高额成本等问题。因此，越来越多的研发团队逐渐转为考虑更低成本的体内原位细胞疗法策略，并开始关注到体内编辑细胞疗法的治疗前景和潜力。

早在2022年初，Moderna与Carisma就宣布建立合作关系，将Carisma的工程化巨噬细胞技术与Moderna的mRNA-LNP技术相结合，以开发体内原位生成嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）疗法。无独有偶，Myeloid Therapeutics也在近期宣布完成了通过LNP-mRNA体内制备靶向TROP2的CAR-M细胞疗法MT-302的临床1期试验首例患者给药，治疗晚期或转移性上皮肿瘤。

在体CAR-M原理

2023年7月19日，山东大学药学院姜新义教授团队在J Control Release上在线发表了题为“Dual mRNA co-delivery for in situ generation of phagocytosis-enhanced CAR macrophages augments hepatocellular carcinoma immunotherapy”的研究论文。该团队制备了靶向肝脏巨噬细胞的脂质纳米颗粒（LNP），同时包封编码CAR和缺乏ITIMs的CD24-Siglec-G（Siglec-GΔITIMs）的mRNA，在肝细胞癌（HCC）小鼠模型中显著提高了肝巨噬细胞的吞噬功能，有效减轻了肿瘤负荷并增加了小鼠存活时间。

构建肝脏巨噬细胞优先递送的LNP-mRNA

早在2022年，美国佐治亚理工大学James Dahlman教授在Nature Communication上发表了题为“Piperazine-derived lipid nanoparticles deliver mRNA to immune cells in vivo”的研究文章，合成了一系列哌嗪衍生的可离子化脂质体（Pi-Lipids）[2]。其中，PPZ-A10构建的LNP以低至0.3mg/kg的剂量优先递送mRNA至肝脏和脾脏免疫细胞，特别是巨噬细胞中。因此在本研究中，为增强LNP-mRNA对肝脏巨噬细胞的靶向，姜新义教授团队采用了哌嗪衍生的可电离脂质PPZ-A10，并以此构建优化了肝脏巨噬细胞靶向的LNP。

经过表征、优化后，研究团队最终采用了DOPE:PPZ-A10:DMG-PEG2000:胆固醇= 16:40:2.5:41.5的配比进行LNP的制备，并发现在PPZ-A10重量比为mRNA 10倍时递送效率最佳，且无严重细胞毒性。

考虑到全身给药时，纳米载体吸附血浆蛋白和其他生物分子而形成的蛋白质冠可能会改变LNP的表面性质，从而影响它们在体内的命运，研究团队还设计了PPZ-A10-LNP与DLin-MC3-DMA在肿瘤细胞和巨噬细胞中的荧光强度对照试验。结果显示，PPZ-A10 LNP组在巨噬细胞中检测到mRNA的绿色荧光信号最高，在肿瘤细胞中检测到的mRNA荧光强度明显低于DLin-MC3-DMA组，证明PPZ-A10 LNPs优先将mRNA递送到巨噬细胞（图1C,D）。

图1. 用于肝脏巨噬细胞靶向LNP的制备表征与评估

在此基础上，研究团队还对吸附在LNP表面的血浆蛋白进行分离和收集，并用质谱蛋白质组学解析蛋白谱。结果发现。共有348种血浆蛋白吸附到PPZ-A10 LNP表面，有161种血浆蛋白吸附到DLin-MC3-DMA LNP表面。研究发现，Vtn和补体蛋白的丰度以及载脂蛋白组成，导致两种LNP细胞嗜性的明显不同。

其中，白蛋白作为LNP的主要吸附物丰度超过25%，其次是载脂蛋白A1（Apo A-I）。这两类蛋白质通过内源性靶向B类I型清除受体(scavenger receptor class B type I, SR-BI)帮助巨噬细胞识别PPZ-A10 LNP。玻连蛋白（vitronectin, Vtn）被确定为PPZ-A10 LNP表面吸附的第三丰富的蛋白质，丰度为8.32%。研究表明，玻连蛋白可通过αvβ3 整合素(integrin)介导的受体内吞作用促进巨噬细胞捕获PPZ-A10 LNP。两种载体吸附的其余大部分蛋白质（如载脂蛋白E）都为脂蛋白，使得它们优先递送mRNA至肝脏。

除此之外，在PPZ-A10 LNP的蛋白质冠中检测到更高比例（16.10%）的补体成分，这些补体成分被切割或重新组装，从而引发巨噬细胞对PPZ-A10 LNP的更多内化（图1H）。

CD24 阻断增强肝脏巨噬细胞吞噬作用

研究发现，CD24表达在HCC肿瘤细胞中明显上调，并与巨噬细胞表面表达的Siglec-G相互作用，逃避吞噬。通过ITIM沉默可以使CD24-Siglec-G介导的免疫抑制信号失活。缺乏ITIMs的Siglec-G（Siglec-GΔITIMs）可以竞争性地与CD24结合，阻碍CD24与天然Siglec-G之间的结合，从而逆转巨噬细胞免疫抑制并显著增强CAR-M的吞噬能力。因此，本研究中使用了Siglec-GΔITIMs mRNA与CAR mRNA共同递送至HCC相关巨噬细胞的策略。

通过设置单独CAR mRNA-LNP处理骨髓源性巨噬细胞（BMDM）的对照组，进一步评估了CAR&Siglec-GΔITIMs LNPs处理的巨噬细胞吞噬活性。如预期的那样，共递送组显著上调了BMDM对Hepa 1-6细胞的吞噬活性，较对照组高10倍（图2D-F）。

在此基础上，团队在体内进一步研究不同CAR mRNA：Siglec-GΔITIMs mRNA配比的抗肿瘤功效。筛选后发现，CAR mRNA:Siglec-GΔITIMs mRNA = 1:2处理的小鼠模型显示出最大程度的肿瘤负荷降低和生存期延长。

图2. CAR-M的抗肿瘤活性

抗肿瘤机制研究

团队进一步研究了CAR&Siglec-GΔITIMs LNP的抗肿瘤机制。通过对治疗后小鼠的肿瘤组织进行流式细胞术分析发现，M1巨噬细胞/M2巨噬细胞的比例显著增加到1.28，而PBS组为0.44，并且肿瘤部位的促炎细胞因子水平，包括IFN-γ和TNF-α明显增加（图3F-G）。这一结果表明，CAR&Siglec-GΔITIMs LNPs具有将巨噬细胞极化向M1表型的能力。此外，还观察到CD86，CD80树突状细胞（DC）的数量增加，共同参与触发抗肿瘤免疫级联反应（图3H）。

静脉注射三次CAR&Siglec-GΔITIMs LNPs后，CD8细胞毒性T淋巴细胞的百分比增加到~35.07%，较PBS组高2.29倍（图3I-J）。同时，检测到髓源性抑制细胞（MDSC）和抑制性调节性T细胞（Tregs）的数量显著下降（图3N-P），表明消耗了浸润的抑制性免疫细胞，协同激活有效的抗肿瘤免疫力以阻止HCC进展并加速HCC消退。

图3. CAR&Siglec-GΔITIMs LNP在原位HCC模型小鼠中的抗肿瘤功效和机制

研究团队还确定了体内静脉注射LNP的生物安全性。在接受不同治疗方案的健康小鼠的血清激酶水平或主要器官切片中未观察到明显的全身毒性，证明了重复给予LNP的可行性。不仅如此，还观察到血清细胞因子水平没有显著差异，验证了原位生成的CAR-M在规避细胞因子释放综合症（CRS）方面的优势（图3Q）。

总结

现如今的巨噬细胞靶向递送系统普遍依赖于靶向配体，如甘露糖、RP-182和CRV等，这些配体的引入使得mRNA递送系统复杂化，并且由于血浆蛋白吸附的影响而无法准确预测配体的靶向作用，实现特异性靶向。因此，没有额外修饰的简单LNPs通过蛋白质冠介导的被动积累或内源性内化将mRNA递送到所需细胞，是mRNA递送到特定巨噬细胞的可行和合理的工具。

本项研究不仅为进一步研究原位CAR-M疗法治疗肝细胞癌提供了证据，同时再次揭示特异性血浆蛋白吸附对LNP靶向能力的重要影响。

参考资料

[1] Yang Z, Liu Y, Zhao K, Jing W, Gao L, Dong X, Wang Y, Han M, Shi C, Tang C, Sun P, Zhang R, Fu Z, Zhang J, Zhu D, Chen C, Jiang X. Dual mRNA co-delivery for in situ generation of phagocytosis-enhanced CAR macrophages augments hepatocellular carcinoma immunotherapy. J Control Release. 2023 Aug;360:718-733. doi: 10.1016/j.jconrel.2023.07.021. 

[2] Ni H, Hatit MZC, Zhao K, Loughrey D, Lokugamage MP, Peck HE, Cid AD, Muralidharan A, Kim Y, Santangelo PJ, Dahlman JE. Piperazine-derived lipid nanoparticles deliver mRNA to immune cells in vivo. Nat Commun. 2022 Aug 15;13(1):4766. doi: 10.1038/s41467-022-32281-5.

E.N.D

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