【文献解读】SciRep: 长读长测序有助于分析病毒病原体的转录组复杂性（方法部分）

                简介                 

标题：Long-read assays shed new light on the transcriptome complexity of a viral pathogen：长读长测序有助于分析病毒病原体的转录组复杂性

杂志：Scientific Reports

影响因子：3.998

发表时间：2020年8月14日

解读：路引Wendy

编辑：很跩的土豆

导读：由于传统方式对转录异构体、多源RNA分子和转录重叠区不敏感，短读测序难以完全表明全部转录组特征分析。长读长测序（Long-read sequencing，LRS）可以通过读取转录本全长克服这些不足。根据已有报道，长读长测序的应用有助于定义机体中的转录复杂性。本研究中，研究者使用Pacific Biosciences 和Oxford Nanopore Technologies的LRS平台来分析牛痘病毒（VACV）转录组。研究者进行了cDNA和直接RNA测序分析，揭示了这种病毒极其复杂的转录情况。尤其是VACV基因产生大量的转录异构体。有一部分VACV转录本开始或结束在邻近基因的编码区域中。该研究为认识牛痘病毒的转录特征提供了新的视角。

                正文                 

1.     细胞培养与感染、提取RNA

研究使用牛痘病毒（vaccinia virus）感染CV-1非洲绿猴肾成纤维细胞系（CV-1 African green monkey kidney fibroblast cells）后，分别共同培养1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16小时后刮取细胞在PBS中冻存备用。研究者使用Macherey–Nagel RNA kit提取总RNA，而后使用Oligotex mRNA Mini Kit (Qiagen)提取PolyA-RNA片段。Ribo-Zero Magnetic Kit H/M/R (Illumina)从总RNA重提取rRNAs。

2.     PacBio RSII and sequel 测序仪

（小TIPS: 美国太平洋生物科学公司推出的三代测序又称作SMRT测序。2013年PacBio推出三代测序仪PacBio RS II, 在2015年10月推出全新三代测序仪PacBio Sequel测序系统，其具有的长读长、高通量、高准确率等特点）

2.1   合成cDNA 

使用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kits (Clontech)从polyA(+) RNA中合成cDNA。不同感染时间的样本用于RSII或Sequel 测序系统检测。使用SMARTer Kit中改良随机hexamer以引物从无rRNA的RNA中逆转录cDNA。

2.2   SMRTbell 库的制备和测序

使用RSII平台的DNA测序试剂盒4.0 v2(DNA聚合酶P6) 进行引物退火和聚合酶结合反应。而Sequel Sequencing Kit 2.1和Sequel DNA Polymerase 2.0则应用于PacBio Sequel测序系统。在上载到PacBio仪器前，聚合酶模板复合物置于磁珠上，使用The PacBio’s MagBead Kit (v2)完成反应。最后使用RSII和PacBio Sequel测序系统拍摄了240或600- movies。

3.     ONT MinION platform–cDNA 测序

3.1   cDNA文库构建

PolyA(+) RNA片段用于cDNA测序。不同感染事件的RNAs根据ONT 1D strand-switching cDNA ligation protocol逆转录为cDNAs。双链cDNAs使用KAPA HiFi DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Ligation Sequencing Kit Primer Mix (from the ONT 1D Kit), and a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems)扩增。PCR片段使用琼脂糖凝胶分离片段大小，片段大于500-bp的产物使用Zymoclean Large Fragment DNA Recovery Kits (Zymo Research)回收。

3.2   cap-selected 样本用于文库准备

研究者使用TeloPrime Full-Length cDNA Amplification Kits (Lexogen)从总RNA逆转录cDNAs。扩增的PolyA- 和Cap-selected的样品根据ONT 1D strand-switching cDNA ligation method (ONT Ligation Sequencing 1D kit)用于文库准备。而后样品使用(NEBNext End repair/dA-tailing Module)修复末端，使用NEB Blunt/TA Ligase Master Mi连接ONT 1D adapters。

3.3   使用MinION测序

ONT 1D-cDNA 和Cap-selected 的文库上载至ONT R9.4 SpotON Flow Cells测序。

4.     ONT MinION platform–dRNA 测序

测序方法为ONT PCR-free direct RNA (dRNA) sequencing protocol (Version: DRS_9026_v1_revM_15Dec2016). 简述如下：各时间点PolyA(+) RNAs用于构建文库。RNA样品，oligo(dT)-containing adapter (ONT Direct RNA Sequencing Kit; SQK-RNA001)，T4 DNA ligase (2 M U/mL; New England BioLabs)混合后孵育10min。

5.     文库纯化

样品使用Agencourt AMPure XP magnetic beads (Beckman Coulter)纯化。

6.     数据分析与可视化

6.1   PacBio数据集

RSII数据按照RS_ReadsOfInsert protocol (SMRT Analysis v2.3.0)生成ROI reads。Sequel数据按照SMRT Link5.0.1.9585生成ROI.

6.2   ONT dataset

  ONT Albacore software v.2.0.1用于MinION数据。ONT’s Guppy (Guppy v.3.6.0)用于验证TSS 和TES位点。

6.3   TSS and TES 位点和转录组的组装和注释

  PacBio ROIs 和ONT reads 与病毒基因组对照(LT966077.1)。应用LoRTIA toolkit (https://github.com/zsolt-balazs/LoRTIA)，转录片段已知的5′- 和3′-和检测的长读reads进行整合。

7.     cis-调节序列预测

提取确定的TSS 上游 100-nt 的序列，并基于 GPMiner 启动子预测工具的in-house script用于分析新转录片段的上游 cis 调控序列。设置条件如下：GPMiner的真核启动子数据库用于搜索完全匹配。使用 Geneious R10 Motif 查找器工具检测病毒早期启动子MOTIF和后期启动子MOTIF。

图1 研究者使用多腺苷酸测序技术检测VACV转录组方案

总结： 本篇研究中同时使用了使用PacBio两个长读长测序平台（RSII和Sequel）和Nanopore MinION分别检测牛痘病毒的转录组。本篇解读主要集中在方法解读，下篇将解读结果，敬请期待！

                参考                 

[1] Tombácz D, Prazsák I, Csabai Z, et al. Long-read assays shed new light on the transcriptome complexity of a viral pathogen. Sci Rep. 2020;10(1):13822. Published 2020 Aug 14. doi:10.1038/s41598-020-70794-5

                索引                 

【往期文献】

                后记                 

随着测序技术的不断发展，科学研究进入了数据井喷的时代。然而，测序样本的处理流程、测序数据的分析流程甚至是数据分析过程中的数据库搭建问题，都给测序技术的普及化设置了壁垒，严重阻碍了该项技术向广大科研工作者中推广。此外，基于长读长的三代测序技术的发展更是引入了一套完全有别于二代测序数据处理的分析流程，为了让更多学者认识三代测序、在科学研究中用好三代测序，本公众号应运而生。期待与您一起学习、成长。

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