CRISPR/Cas9传奇之路
2016年5月的一个早上刚睡醒，迷迷糊糊打开朋友圈，突然被一个从来没听说过的人名刷屏了，韩春雨，河北科技大学。细细看完朋友圈的相关介绍才知道，此人在Nature Biotechnology上发表了一篇名为《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》的研究论文，直接创新了一项前沿的基因工程技术。
时隔两个月，韩教授和他的学生高峰又再次走到了风口浪尖，多个实验室对韩教授工作的重复并没有得到相同的结果，但也有少数的实验室完成了对此技术的重复，方舟子也借此发表了他的“高谈阔论”，一时间是非真相扑朔迷离。
说到DNA引导的基因编辑就不得不提到他的基础RNA引导的基因编辑，也就是我想要说的CRISPR/Cas9，今天我们就说说它的传奇。
CRISPR/Cas9的发现也经历了一段传奇历程。众所周知，基因工程的基本操作可以简单的分为分、切、接、转、筛。记得在我们的高中课本上，对如何切断DNA双链，还在讲限制性内切酶在质粒上切出黏性末端，然后用相同的限制性内切酶切出目的基因，接着在DNA连接酶的作用下形成一个重组的DNA分子。这一步是基因工程的核心，同时也是受到局限性最大的一步。
近年来，一些基因编辑技术又得到了提高，包括Zinc-finger nuclease (ZFNs),transcription activator-like effector nucleases(TALENs)。但这两种技术都有明显的局限性，无法达到任意位点的DNA double-stranded breaks (DSBs)，而CRISPR/Cas9的原理简单来说就是： crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。
而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。从原理上，CRISPR/Cas9似乎已经达到了可以在任意位点对DNA进行DSBs，但实际上此技术也有其相应的局限性，但是相较前两项技术，已经极大的提高了基因编辑技术。
CRISPR/Cas9
早在1987年, Ishino Y发表了《Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product》，在这篇文章中第一次提及了这样的一个基因序列，但是因为其作用机理没有实验依据，没有得到重视。
Ishino Y
13年后，2000年，Mojica FJ在文章《Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria》中对这样一个基因序列再次进行了描述，并提出在原核生物中存在这样一个family。而这个时候都还没有对这样的序列进行命名。
直到2002年，Jansen R在文章《Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes》中才对这样的结构进行了命名，称为clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)从此开启了它的传奇之路。紧接着5年后，
2007年，Barrangou R在Science上发表了他的文章《CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes》，第一次用实验结果证实了CRISPR在原核生物获得性免疫中的作用。在2007年到2011年之间，关于CRISPR的发现越来越多。
2011年，Deltcheva E在Nature上发表文章《CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III》提出了tracrRNA forms a duplex structure with crRNA in association with Cas9。从这时起，CRISPR/Cas9进入了飞速发展的时代。
2013年，CRISPR/Cas9终于从原核生物走到了真核生物，Mali P在Science上发表文章《RNA-guided human genome engineering via Cas9》，这个时候，CRISPR/Cas9终于作为一门基因工程技术呈现在了世人眼前。随后在2014年，Hiroshi Nishimasu在Cell上发表文章《Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA》，Cas9的结晶结构也被成功确立。
而CRISPR/Cas9也广泛的应用于基因编辑技术中，直到韩春雨教授用一篇《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》对其统治地位发起了冲击。
韩春雨
结语：CRISPR/Cas9作为一门重要的，新兴的，前沿的基因编辑技术，在基因工程中发挥的重要作用不言而喻。科学的进步就是靠着不断的探索取得，我们期待着更多更好的技术的发现，从而为我们解决科研问题提供更多的选择。
此文仅作为抛砖引玉之文，欢迎大家批评指正，本人现任职于军事认知与脑科学中心神经信号转导研究室，主要从事胶质瘤（glioma）相关研究，本实验室开设硕士、博士及博士后相应学位，欢迎各位报考本实验室研究生，共同奋战在医学事业中，另外如有需要各种文献检索而无条件的同志们，可将需要文献作者，文献全名发给我，留下email，查好后发于各位邮箱。
参考文献：
1. Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol. 1987; 169:5429–5433. [PubMed: 3316184]
2. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Mol Microbiol. 2000; 36:244–246. [PubMed: 10760181]
3. Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 2002; 43:1565–1575. [PubMed: 11952905]
4. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007; 315:1709–1712. [PubMed: 17379808]
5. Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao Y, Pirzada ZA, Eckert MR, Vogel J, Charpentier E. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 2011; 471:602–607. [PubMed: 21455174]
6. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013a; 339:823–826. [PubMed: 23287722]
7. Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD, Konermann S, Shehata SI, Dohmae N, Ishitani R, Zhang F, Nureki O. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 2014; 156:935–949. [PubMed: 24529477]
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