ISME：厌氧消化器中rRNA操纵子拷贝数的微生物功能特性
厌氧消化器中rRNA操纵子拷贝数的微生物功能特性
随有机物水平的增加而增加
Microbial functional trait of rRNA operon copy
numbers increases with organic levels in anaerobic digesters
作者：Linwei Wu, Yunfeng Yang, Si Chen, Zhou Jason Shi, Mengxin Zhao, Zhenwei Zhu, Sihang Yang, Yuanyuan Qu, Qiao Ma, Zhili He, Jizhong Zhou and Qiang He
单位：清华大学环境学院
期刊：The ISME Journal
时间：2017.6
IF：9.52
DOI: 10.1038/ismej.2017.135
研 究 背 景
r-K生活史策略的生态学概念（资源丰富时为r-对策者受益，当资源受到限制随后被K-对策者取代）在宏观生态学中被广泛应用于描述类群的功能特性，但缺少一种可测量的、方便的功能特性来分类，因而在微生物群落中的应用受到限制。之前的微生物分离培养实验揭示了rRNA操纵子拷贝数与该微生物响应资源可用性的能力呈正相关性。也就是说，具有少量rRNA操纵子的生物往往是K-对策者；具有多个rRNA操纵子的倾向于r-对策者，在资源丰富时占主导地位。然而，微生物群落的平均rRNA拷贝数对资源可用性的响应程度仍然难以确定。
本研究中，设计厌氧消化器，逐步提高其中的有机物水平，量化研究资源可用性水平如何影响微生物群落组成，并探索支持rRNA操作子拷贝数是反映资源可用性的有意义的生态学特征的依据。
实 验 设 计
1、方案设计
设置对照反应器（仅以牛粪为基质）和混合反应器（以牛粪为基质，并分两次添加家禽粪便，提高反应器内资源可用性），一式三份；对照反应器的有机负荷率（organic loading rate, OLR）水平始终维持在 1.0 g 挥发性固体（volatile solid, VS）/L/day。混合反应器的OLR水平维持为：1-44天为1.0 g VS /L/day，45-76天为1.3 g VS/L/day，77-98天为1.5 g VS/L/day。在每个OLR水平下，分5或6个时间点从反应器中采取污泥样品，测定分析沼气量、甲烷、总氨氮、pH、VS、VS移除率及醋酸盐含量共7个化学指标。
2、微生物群落分析
DNA提取，扩增16S rRNA基因V4区（515F、806R）基于MiSeq Illumina平台测序。以97％相似性聚类OTU，通过rrnDB数据库估算每个OTU的rRNA操纵子拷贝数，并计算每个样品的丰度加权平均rRNA操纵子拷贝数；对三个时间点（第45、73和90天）的三份污泥样品进行TagMan qPCR分析，分别测定Methanosarcina、Methanosaeta以及古菌种群，以确定两种产甲烷菌的相对丰度；采用GeoChip 5.0功能基因芯片检测，分析碳循环过程中的水解、酸化、已酸化与甲烷化作用，明确厌氧消化器中的不同功能组成对有机物水平的响应。
主 要 结 果
VS作为反应器中资源可用性的标示，混合反应器VS含量逐步由14.15 ± 0.17 g/ L 增加到 17.80 ± 0.26 g/L。且混合反应器中甲烷产量与OLR的增加成正比，表明该微生物功能未受到抑制。相反，单一基质的对照反应器中甲烷产量、沼气产量与VS的移除率都保持稳定。
结果显示OLR首次和第二次增加时对照组和混合反应器中微生物组成存在显著差异（MANOVA置换检验分别为：F=5.30，P=0.001；F=11.01，P=0.001）。OTU动力学响应的热图分析结果，将OTUs分类为三组：组1包括所有样本中均丰富的OTUs；组2是在混合反应器中富集的OTUs；而组3为在混合反应器中减少的OTU。由图1b可以看出组2和组3的系统发育不同。例如，组2中71.8%的OTUs属于Firmicutes，显著高于组3（39.1%）和所有检测到的OTUs组（52.7%）。且组2中有9.4 %的OTU属于放线菌门，但不存在于组3。
图1. OLR操纵下细菌分类成分的动态变化
（a）对照组和混合反应器的PCoA分析（b）各组OTUs的门水平分类信息：group1为所有样本中均丰富的OTUs；group2为混合反应器富集的OTUs；group3为混合反应器中减少的OTUs；all为所有检测到的OTUs（c）每组OTUs的rRNA操纵子拷贝数的估算平均值
ANOVA分析表明不同组间的平均rRNA操作子拷贝数存在显著差异（P＜0.001），且其随OLR增加而增加。由图2b得知，丰度加权的平均rRNA操作子拷贝数与不同反应器中的VS水平两者之间存在很强的线性相关性，且随时间的推移呈递增趋势。这一发现表明，当VS水平较高时，rRNA操作子拷贝数较高的微生物更受青睐。因此，在实验培养条件下，鉴于rRNA操作子拷贝数与系统发育的保守性，且无自然群落中的复杂交互作用，rRNA操作子拷贝数可以用于微生物群落的常规分析。
图2. OLR对微生物群落丰度加权平均rRNA操作子拷贝数的影响
（a）群体的丰度加权平均rRNA操作子拷贝数随时间的变化（b）线性回归显示微生物群落的丰度加权平均rRNA操作子拷贝数与各反应器VS水平之间的相关性
GeoChip检测微生物功能基因组成，第一次OLR增加时保持不变（F= 0.66，P = 0.49），但在第二次OLR增加时显著改变（ F=4.65，P＜0.005），这表明微生物功能特征可能比宏观生态学中观察到的分类特征更能抵抗环境干扰。
在对mcrA基因序列研究中显示，来自于Methanosaeta的平均信号强度高于Methanosarcina，这与qPCR数据一致。且qPCR与GeoChip分析均表明Methanosaeta在第二次增加OLR时显著增加，被认为是r-对策者。细菌与古菌的研究结果一直，表明r-对策者群落的富集是由OLR增加引起。
小 结
微生物群落的物种组成和功能特征均对厌氧消化器中的有机物水平变化敏感，r-对策者在高OLR水平下富集；
微生物群落的平均rRNA操纵子拷贝数与有机物水平之间的正线性相关性，指出通过调整有机物水平操纵r-至K-对策者微生物群落的可能性。
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