BMC Medicine：早期遭受逆境的儿童的生长迟缓与大脑功能连接和认知结果的改变有关

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生长迟缓影响全世界约1.61亿儿童，损害其早期的认知发展。在低收入环境下，使用神经成像工具和敏感的行为测试相结合的研究很少，这阻碍了研究人员解释生长迟缓如何影响大脑和行为发展的能力。波士顿儿童医院认知神经科学实验室在BMC Medicine杂志发表文章研究该主题。研究者使用高密度EEG检测儿童身体生长、脑功能连接（FC）和认知发展之间的关系。

研究方法：婴儿组包括92名孟加拉婴儿，分别在3、4.5、6个月时，测量其身高/身长；6个月时，测量其EEG信号（基线）；27个月时，采用Mullen Scales of Early Learning评估认知能力（MSEL）。年长组包括118名儿童，分别在24、30、36个月时，测量其身高；36个月时，测量其EEG信号；48个月时，评估其IQ智商。基于世界卫生组织标准，计算Height-for-age（HAZ）z分数。并在皮质源空间上计算不同频带下的EEG FC。进行线性回归和纵向路径(longitudinal path)分析，以检验变量之间的关系，并且检验身体生长通过FC对认知结果的间接影响。

研究结果：在年长组中，研究者发现在theta和beta频带中，HAZ与FC呈负相关，且FC与儿童48个月时的IQ评分呈负相关。纵向路径分析结果显示在theta和beta频带中，HAZ通过FC间接影响儿童IQ智商。在婴儿组中，HAZ与FC或后期认知结果没有关系。

研究结论：身体生长与FC（功能连接）之间的关系可能反映了营养不良对儿童大脑发育的广泛有害影响。FC在身体生长与智商的关系中起中介作用，这一结果表明FC可能作为一种神经通路，通过这条通路，逆境影响认知发展。

研究背景

在幼儿期处于不利条件中对儿童身体、心理健康及发育均有影响。发育迟缓是慢性营养不良的指标，并且影响世界很多儿童，尤其是低收入国家儿童。根据联合国儿童基金会、世界卫生组织和世界银行的最新报告，1.59亿5岁以下儿童都属于发育不良（即HAZ分数低于WHO标准中位数的2个标准差）。慢性营养不良（发育迟缓的原因）与大脑发育迟缓、认知能力差有关，而这反过来又影响儿童能在多大程度上实现其发展潜力。足够的营养是大脑和认知发展所必需的，但儿童早期营养不良与后来认知结果有关的机制仍不清楚。这是由于在低收入环境中（生长迟缓很常见）缺乏使用神经影像学和敏感行为测量的研究。

本研究旨在探索在贫困、资源匮乏的孟加拉国的儿童发育迟缓（慢性营养不良的指标）和大脑功能之间的关系。重点关注HAZ和源空间EEG功能连接（FC）之间的关系，以及FC是否调节HAZ（Height-for-age Z分数）和认知功能之间的关系。已有研究使用不同频带EEG FC探索正常发展儿童和暴露于早期逆境的儿童之间的大脑网络效率和组织发展。FC变化通常由于大脑网络的组织和功能变化。由于暴露于生物逆境，某些回路的FC异常模式与后来认知表现的缺陷有关。因此，通过不同频带的神经振荡，皮层区域之间进行沟通，这种沟通表征一条通路，该通路在幼儿期因慢性营养不良而中断，这反过来又可能导致认知结果的缺陷。

大量的人类和动物研究证明营养不良（例如发育迟缓）与大脑发育的非典型模式有关。例如，人类死后的解剖学证据显示，与营养良好婴儿相比，3-4个月营养不良婴儿的初级运动皮层（中央前回）树突生长减少。此外，产前饥荒的成人的白质（WM）具有高强度。在遭受饥荒的人群中，WM体积增加可能是由于生命早期营养物质供应不足，无法维持和替换髓鞘丢失后分解的髓鞘化和胶质化。动物模型支持营养不良婴儿的组织学证据，啮齿动物的研究发现，营养不足与皮层神经组织中突触和神经元的密度降低以及胼胝体连接改变有关，这可能是由于神经元增殖减少以及髓鞘形成和突触改变所致。与营养不良有关的神经元和大脑体积变化可能导致不良的认知结果。迟缓对儿童认知发展具有不利影响，而这又导致教育和劳动力市场结果恶化，包括收入和生产力下降。此外，与青春期相比，婴儿期和儿童期发育迟缓更有可能对成年人的健康造成负面的长期影响。

出生后的前几年是神经迅速变化的关键期，在此期间，经验对神经和认知发展有很强的影响，而生活在低资源环境中的儿童往往会处于各种生物、社会心理和环境逆境中。本研究主要探讨生活在低资源环境中的儿童（发育迟缓率高），其HAZ、大脑功能和认知结果之间的关系。

方法

被试

婴儿组包括92名孟加拉婴儿，分别在3、4.5、6个月时，测量其身高/身长。

年长组包括118名儿童，分别在24、30、36个月时，测量其身高。

身体生长测量

测量婴儿的仰卧身体长度和年长儿童的身高。每次评估测量两次长度/高度，两次的均值用于分析。基于WHO标准，对每次评估的被试HAZ进行标准化。由于几次评估中的HAZ分数高度相关（婴儿组：rs>0.72; 年长组：rs>0.91），因此，将三次评估的数据平均以获得对身体生长的稳定估计，同时减少测量误差和数据缺失（即婴儿组：平均3-6个月的数据，年长组：平均24-36个月的数据）。将生长迟缓定义为HAZ低于WHO标准中位数的2个标准差。婴儿组3-6个月的平均HAZ是1.14。生长迟缓的比例是16.30%（15/92）。年长组24-36个月的平均HAZ是-1.64，生长迟缓的比例是33.06%（39/118）。在线性回归模型和纵向路径分析中，HAZ作为连续变量。考虑到36个月时具有高比例的生长迟缓儿童，研究者将年长组分为3个组：生长迟缓（n=39）、中等HAZ（n=39）、高HAZ（n=40），依据FC和认知结果检验生长迟缓儿童与非-生长迟缓儿童的区别。

认知评估

采用Mullen Scales of Early Learning (MSEL)测量婴儿组中的74人在27个月时的认知结果。对4个子量表（精细动作、视觉接收、接受性语言、表达性语言）的分数进行标准化，并计算反映全局认知发展的综合分数。采用Wechsler Preschool and Primary Scale of Intelligence (WPPSI-III)测量年长组中112人在48个月时的认知结果。计算代表一般智力的IO分数。

EEG数据采集和处理

在婴儿组6个月以及年长组36个月时采集其EEG数据。让儿童看一个具有抽象形状的屏幕同时听舒缓声音，使用128导HydroCel Geodesic Sensor Net (HGSN)系统采集2min EEG数据。采样率为500Hz。

使用EEGLAB和ERPLAB对数据进行预处理：

1. 采用8阶Butterworth带通滤波（1-50Hz）对数据进行滤波，然后进行分段，分段时长为1s。

2. 将绝对值大于100微幅的部分标记为伪迹并去除。

3. 使用EEGLAB函数“EEG_interp”的球形插值方法进行通道插值，如果数据中的坏电极超过18个，则去除该数据。

4. 采用ICA去除眼动、眨眼、以及其他伪迹。具体使用SASICA和ADJUST中的函数和算法识别伪迹成分，并只删除两种方法都标记出来的伪迹成分。

源空间的EEG FC分析

Fig. S1 源空间水平上，EEG FC分析的流程。

源水平重建步骤：

1. 使用FieldTrip对头皮EEG数据进行皮层源重建：使用神经发育MRI数据集的平均MRI模板（即6和36个月）创建真实头模型，采用此模型对头皮EEG数据进行皮层源重建；

2. 分割MRI模板，并使用有限元方法（FEM，finite element method）建立每个年龄组的正演模型；

3. 采用适合年龄的颅骨电导率建立模型，然后利用正演模型估计lead field矩阵和空间滤波矩阵（lead field矩阵的逆）。

4. 作为反演模型的约束条件，使用eLORETA对EEG时间序列进行分布式源重建，并利用LPBA40脑图谱将重建的源活动分割成48个ROI。用源空间时间序列对48个皮层ROI进行FC分析。

FC分析过程

1. 使用加权相位滞后指数（ wPLI,weighted phase lag index)评估不同频带ROI之间的FC; 用于测量相位与相位之间的同步性，根据滞后程度对相位差异进行加权，以减少噪音的影响）。并且采用试次随机置换的方法减少试次数量对wPLI估计的影响。

2. FC分析得到48×48的加权邻接矩阵，矩阵中的每个元素表示一对ROI的连通性。接下来对数据进行Fisher’ r-to-z变换。

3. 在矩阵中使用0.2的稀疏阈值。此外，还进行了阈值为0.3和0.1的分析。

     4. 分析频带包括：theta (6 months: 3-6 Hz; 36 months: 3-7 Hz), alpha (6 months, 6–9 Hz; 36 months, 7–10 Hz), beta (6 months, 10–20 Hz; 36 months, 11–20 Hz), gamma (6 and 36 months, 20–40 Hz) bands。

5. 将48个ROI分为4个脑区：额叶（F）、颞叶（T）、顶叶（P）、枕叶（O），计算四个脑区内部以及脑区之间的FC：FF, FT, FP, FO, TT, TP, TO, PP, PO, OO。执行探索性分析检验四个脑区内部以及脑区之间的FC与HAZ的关系。对多次分析进行FDR矫正。用iCOH（相干的虚部）估算EEG FC的验证性分析，结果与wPLI的结果类似。

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协变量

在出生后不久通过家庭观察和标准化问卷对社会经济地位（SES，socioeconomic status ）进行评估。根据多项相关指标，包括收入-需求四分位数、房屋建筑材料和家庭资产，将SES计为潜在因素。在进行EEG分析时，还利用Family Care Indicators (FCI)对家庭护理活动进行了评估。该量表包括5个子量表评估家庭刺激。其中4个子量表评估家庭中可用的游戏材料、书籍、杂志和报纸的种类。另外一个“游戏活动”子量表评估父母或其他照顾者在过去3天内与儿童一起进行的刺激活动的数量。以这些量表的总分作为家庭护理指标。最后，在采集EEG时，测量被试头围。

统计分析

1. 使用IBMSPSS分别对每个频带上的FC执行线性回归模型，以检验HAZ与FC之间、FC与认知结果之间联系。只有与HAZ和认知结果有显著关系的频带才能在纵向路径分析中（联系HAZ与后来的认知结果）得到进一步的检验。

2. 使用Mplus中的纵向路径分析检验假设的中介调节模型。具体来说，中介调节模型检验HAZ通过FC对认知结果的间接作用。使用全信息最大似然估计（FIML，fullinformation maximum likelihood）处理认知结果的缺失值。基于一个非显著的X² (p > 0.05), CFI > 0.95, SRMR < 0.08以及RMSEA < 0.06进行模型拟合评价。使用bootstrap方法估计间接效应，抽取次数为5000次。

结果：

儿童生长和大脑平均FC

Fig. 1 6个月（红）婴儿和36个月（绿）儿童的全脑平均功能连接谱密度（FCSD）。

1. 全脑平均FC在不同频带之间有显著差异，6个月的婴儿在theta频带达到峰值；而36个月的儿童在alpha频带达到峰值（Fig. 1）。使用MATLAB中的“findpeaks.m”函数提取峰值频率，将其与HAZ的关系进行分析。结果发现两者无显著相关，然而相对于36个月高HAZ组，生长迟缓儿童的全脑FC的峰值频率似乎更慢（Fig. 2）。

Fig. 2 在theta, alpha, beta, gamma频带上，6个月婴儿和36个月儿童的全脑FCSD。对于6个月婴儿来说，绘制HAZ最高1/3和最低1/3婴儿的FCSD。对于36个月年长组，绘制高HAZ组和生长迟缓组的FCSD（各占1/3）。

2. 使用线性回归模型检验HAZ和FC以及FC和其他协变量在不同频带上的关系。对于婴儿组来说，HAZ或其他协变量（SES，家庭护理和头围）与全脑FC在任意频带上均无相关。对于年长组来说，在theta和beta频带上，24、36个月儿童的HAZ与36个月儿童的FC具有显著的负相关。更低HAZ的儿童具有更强的全脑FC（Fig. 3）。线性回归模型也揭示了beta频带的FC与SES之间的关系边缘显著。Gamma频带的FC与其他任何指标均无显著相关。36个月的儿童进一步分为生长迟缓组和非生长迟缓组。相对于高HAZ组，生长迟缓组在theta和beta频带上的全脑FC更强（Fig. 2, 4; Fig. S3）。由于有2名3岁儿童的平均HAZ大于1（Fig. 3，在贫困区很少见），因此，作者在提剔除两名被试后，重新检验EEG FC和HAZ的联系，结果类似。

Fig. 3 在theta和beta频带上，HAZ与标准化FC之间的线性相关。对6个月婴儿（红）和36个月儿童（蓝）分别绘制回归曲线。

Fig. 4 生长迟缓组和非生长迟缓组在theta和beta频带上的全脑平均FC。

皮层脑区之间的连接（边）是使用相同的阈值绘制，线越粗，FC值就越高。不同颜色表示不同脑区的ROI：蓝色表示额叶，绿色表示颞叶，黄色表示中部和顶叶，红色表示枕叶。

Fig. S3 在theta和beta频带上，FC的平均邻接矩阵（生长迟缓组、中等HAZ和高HAZ）。额叶、颞部、顶叶和枕部ROI分别分别对应于蓝色、绿色、橙色和红色。

身体生长与脑区内部以及脑区之间的FC

    在theta和beta频带上进行探索性分析，检验脑区内部以及脑区之间的FC是否与HAZ有关。同样使用线性回归模型，但是用脑区内部以及脑区之间的FC代替全脑FC（FF, FT, FP, FO, TT, TP, TO, PP, PO, OO），并且采用FDR进行多重比较矫正。结果显示在theta频带上，HAZ与大部分脑区内部以及脑区之间FC呈显著负相关（除了颞叶与顶叶之间的FC以及枕叶内部FC）。相反，在beta频带上，HAZ仅与枕-颞FC、枕-顶FC相关。

FC与后期认知结果

执行线性回归分析检验不同频带的全脑FC是否与IQ前瞻性地相关。

1. 对于年长组来说，在alpha和beta频带上，36个月儿童的FC与48个月儿童的IQ分数呈显著负相关。在theta频带上，36个月儿童的FC与48个月儿童的IO分数呈轻微显著。除此之外，线性回归模型揭示了SES与IQ呈显著正相关。

2. 对于婴儿组来说，FC与MSEL综合分数之间无显著相关。

通过FC将身体生长与认知结果联系起来的纵向路径模型

由于在年长组中发现HAZ、FC以及认知结果之间的强联系，因此研究者仅在年长组执行中介调节模型。研究者分别在theta和beta频带检验HAZ通过FC对48个月儿童IQ分数的间接作用。

1. theta模型显示出可接受的模型拟合：χ²(1) = .277, p = .599; CFI = 1.0; SRMR = .009; RMSEA < .001；然而，相对于定义的可接受模型拟合参数，beta模型则显示出比较差的模型拟合（更小的CFI以及更大的RMSEA）：χ²(1) = 2.918, p = .088; CFI = .939; SRMR = .030; RMSEA = .127。由于在alpha和gamma频带上，FC与HAZ无显著相关，因此未对该数据进行中介调节模型拟合。

  2. 纵向路径分析揭示了在theta和beta频带上，36个月儿童的FC与HAZ呈显著负相关，与48个月儿童IQ分数呈显著负相关（Fig. 5）。尽管生长迟缓组儿童确实表现出低于非生长迟缓儿童的IQ，但在包括所有协变量在内的路径模型中，HAZ对IQ的直接影响不显著（Fig. S2）。在theta和beta频带上，HAZ通过FC对IQ具有显著的间接影响（Fig. 5a, b）。

Fig. 5 使用纵向路径分析检验多元中介调节模型。

a) theta频带FC的模型；

b) beta频带FC的模型。实线表示显著相关，虚线表示不显著相关。

Fig. S2 生长迟缓组、中等HAZ和高HAZ组儿童在48个月时的IQ。生长迟缓组IQ与高HAZ组IQ差异显著。

总结

本研究是首次对生活在低收入国家的儿童生长迟缓、FC和认知结果之间的关系进行探索的研究。研究者的结果发现：对于生活在低收入国家儿童来说，早期身体生长（HAZ）与脑网络连接（在theta和beta频带上，脑区之间的FC）的变化有关。在年长组中，研究者也发现FC与后期的认知结果有相关关系。相反，在婴儿组中，HAZ与FC或者MSEL综合分数无相关关系。这证明生长迟缓（慢性营养不良的指标）与广泛的EEG功能连接潜在相关；在前5年的生活中，EEG功能连接又与后期更差的认知结果有关。目前的研究结果促进研究者对一些神经通路的理解，通过这些神经通路，生长迟缓可能与认知发展有关，并且这一进展可能对生活在低收入国家的儿童制定有效的干预措施产生重大影响。

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