只需5步，快速学会CRISPR/Cas9的sgRNA设计

CRISPR/Cas9可以说是近几年来生物医学领域最火的技术了，自2013年诞生以来就光芒四射，给生物医学领域带来巨大冲击，CRISPR/Cas9相关的科研成果频频登上顶尖期刊，国内CRISPR/Cas9相关的研究也是如火如荼。

CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计crRNA和tracrRNA这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。

使用CRISPR/Cas9编辑基因成败的关键就在于sgRNA，在线设计sgRNA的网站有很多，本文重点推荐并介绍一个功能丰富，操作非常简单的站点http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/，整个设计过程只需5步。点击文末“阅读原文”下载PDF版设计教程。

第一步

选择基因编辑类型（敲除，抑制或激活基因表达等），本文以敲除为例（图1）。

图1.选择基因编辑类型

第二步

输入基因序列（以人的MYC外显子2基因为例）

输入的基因序列的格式是raw 或 fasta，序列长度为< 10000bp（图2）

图2.输入基因序列

第三步

选择spacer长度，开始扫描（图3）

选择spacer的长度，以19nt为例，点击scan按钮即可直接出现该基因序列上（正反链）所有可能的sgRNA的序列，开始和结束位点，分数，以及正反链。

图3.扫描基因正反链所有sgRNA

第四步

导出文件（图4），点击下方Export to file即可导出所有sgRNA信息的文件

图4.导出并保存文件

第五步

打开文件，挑选合适的sgRNA（以正链为例）（图5）

在Score这一列显示每一条sgRNA的敲除效率分数，分数越高敲除效率越高。但是这些的sgDNA位置有一些并不总在ATG的下游，所以根据位置，对于做基因的敲除（KO）而言，强烈建议选择CDS区ATG下游通常100aa以内范围的sgRNA。（比如图4中的6较下游同时分数较高的）。

图5.挑选合适的sgRNA

一般针对一个基因选择3到6条sgRNA，选择合适的sgRNA后便可以克隆载体上了。

点击文末“阅读原文”下载PDF版设计教程。