大家担心的问题出现了: 疫苗mRNA可逆转录为DNA

2月25日，瑞士隆德大学临床科学系的研究人员发现辉瑞公司和BioTeCo开发的mRNA COVID-19疫苗在人类细胞可以逆转录为DNA。 

截至2022年2月，新冠病毒已导致4亿3000万多例感染病例和590万例死亡病例，迫切需要的有效和安全的疫苗。已研制成功的疫苗包括mRNA疫苗（辉瑞-BioNTech公司和Moderna 公司）、复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗（Janssen-Johnson and Johnson公司、Astra-Zeneca公司, Sputnik-V公司和CanSino公司）和灭活疫苗（Sinopharm公司, Bharat Biotech 公司和Sinovac公司）。mRNA疫苗在设计和制造方面具有灵活高效的优点，有许多候选疫苗处于不同的开发和应用阶段，应用于不同的疾病。辉瑞公司和BioNTech公司开发的COVID-19 mRNA疫苗BNT162B2在临床试验中效果也很好。

BNT162b2是一种脂质纳米粒（LNP）包裹的修饰RNA疫苗（modRNA），编码SARS-CoV-2 spike（S）蛋白，有两个脯氨酸突变以确保抗原性最佳。研究表明，SARS-CoV-2 RNA可以被反转录并整合到人类细胞的基因组中。这就产生了这样一个问题：编码部分SARS-CoV-2 RNA的BNT162b2是否也会出现这种情况？

在辉瑞公司向欧洲药品管理局（EMA）提供的药代动力学数据中，BNT162b2在小鼠和大鼠体内的的大多数组织中检测到，注射部位和肝脏是主要分布部位，在给药后8-48小时观察到最大浓度。此外，在接受BNT162b2注射的动物中，观察到可逆的肝脏不良反应，包括肝脏增大、空泡化、γ-谷氨酰转移酶（γGT）水平升高、天冬氨酸转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）水平升高。然而研究表明不含modRNA的空LNP不会引起任何明显的肝脏损伤。因此，作者研究BNT162b2是否可以通过内源性机制反转录到DNA中导致肝脏损伤。

为了确定BNT162b2是否进入人类肝细胞，作者将人类肝细胞系Huh7培养在含BNT162b2的培养液中，在0.5、1.0和2.0µg/mL下培养6、24和48小时。然后从细胞中提取RNA，并使用针对BNT162b2序列的引物进行实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR），如图1所示。

图1  PCR引物用于检测BNT162b2的mRNA水平和逆转录。

RT-qPCR结果显示，BNT162b2处理的Huh7细胞在6小时、24小时和48小时的BNT162b2 mRNA水平高于看家基因水平。

那么BNT162b2对人内源性逆转座子LINE-1有影响吗？作者接下去研究了BNT162b2对人类逆转座子LINE-1基因表达的影响。与对照组相比，在6小时时观察到LINE-1表达显著增加。免疫荧光染色显示，在所有浓度下，BNT162b2都增加了整个细胞区域和细胞核中的LINE-1 ORF1p蛋白水平（图2）。

图2 BNT162b2处理的Huh7细胞的免疫组织化学图。对照（Ctrl）或0.5、1和2µg/mL BNT162b2处理Huh7细胞6小时。（a）Huh7细胞中LINE-1表达的代表性图像。全细胞（b）、胞质（c）和胞核（d）中LINE-1蛋白的定量。

先前的研究表明，LINE-1蛋白进入细胞核与逆转录转位有关。为了检测当LINE-1升高时BNT162b2是否反向转录到DNA中，作者用0.5µg/mL BNT162b2处理Huh7细胞后纯化DNA。纯化的DNA用RNA酶处理以去除RNA，并使用针对BNT162b2的引物进行PCR。扩增的DNA片段通过电泳观察。在所有三个时间点（6、24和48小时）检测到BNT162b2 DNA扩增子。Sanger测序证实DNA扩增子与BNT162b2序列相同。为了确保DNA扩增子来自DNA，而不是BNT162b2 RNA，作者还对RNA进行了PCR，结果在RNA样本中未检测到扩增子。

图3 经BNT162b2处理的Huh7细胞中BNT162b2的DNA扩增子。在琼脂糖凝胶上观察DNA扩增产物（444bp）。

在这项研究中，作者提出了新冠病毒 mRNA疫苗BNT162b2能够在体外进入人肝细胞系Huh7反转录为DNA。逆转录的一种可能机制是通过内源性逆转录酶LINE-1。人类LINE-1是一种细胞内源性逆转录酶，是人类唯一的活性转座子，约17%的人类基因组由LINE-1序列组成。Alu元件、SINE元件、可变数量的串联重复序列（VNTR）以及假基因都是由LINE-1反转录转座进行反转录转座的。

最近的一项研究表明，内源性LINE-1介导了SARS-CoV-2序列在感染人类细胞基因组中的逆转录和整合。此外，内源性LINE-1的表达在病毒感染（包括SARS-CoV-2感染）时经常增加。在这个研究中，作者观察到在所有浓度（0.5、1和2μg/mL）下，BNT162b2促进 LINE-1表达。

在人体是否会发生mRNA疫苗整合到基因组中？如果整合的话，是否会导致长期的不良后果？是否有生殖毒性？这些疑问有待进一步的观察来回答。

参考文献：

Intracellular Reverse Transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA Vaccine BNT162b2 In Vitro in Human Liver Cell Line. Curr. Issues Mol. Biol. 2022, 44(3), 1115-1126; https://doi.org/10.3390/cimb44030073

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