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法庭科学DNA实验室检验规范 GAT 383—2014(20140509)

戴卫祥 司法鉴定律师 2021-04-01

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法庭科学DNA实验室检验规范 GAT 383—2014(20140509)

法庭科学DNA实验室检验规范 GAT 383—2014已经中华人民共和国公安部2014年5月9日发布,自2014年5月9日起施行。


目 录

前 言

1 范围

2 规范性引用文件

3 术语与定义

4 前期检验

5 DNA提取与纯化

6 DNA定量

7 人类DNA性别及STR(short tandem repeats)多态性分析

8 人类线粒体DNA测序

附录A (规范性附录)DNA的提取和纯化方法

附录B (规范性附录)常用试剂推荐配方


·前言

本标准按照GB/ T 1.1—2009给出的规则起草。

本标准代替GA/T 383—2002《法庭科学DNA实验室检验规范》,与GA/T 383—2007相比主要技术变化如下:

——删除了定义“有机溶剂法”“Chelex法”“硅珠法”和“CTAB法”,将这部分内容移入正文中(见5.1、5.2、5.3和5.5,2002年版的2.2、2.3、2.4和2.5);

——增加了“DNA提取”的术语和定义(见3.2);

——增加了“遗传标记”的术语和定义(见3.3);

——删除了案件受理有关的内容(见2002年版的第3章);一删除了检材的提取和保存有关的内容(见2002年版的第4章);

——删除了前期检验血痕检验种属试验一环状沉淀试验的有关内容(见2002年版的5.1.2);

——删除了前期检验血痕检验种属试验一对流免疫电泳法的有关内容(见2002年版的5.1.3);

——删除了前期检验血痕检验种属试验一金标试纸检验法的有关内容(见2002年版的5.1.4);

——增加了前期检验血痕检验预检验中鲁米诺检验的有关内容(见4.1.1.2);一增加了前期检验血痕检验确证检验中金标试纸检验法的有关内容(见4.1.2);

——删除了前期检验精斑检验中预检验一酸性磷酸酶试验的有关内容(见2002年版的5.2.1);

——增加了前期检验精斑检验中确证检验一金标试纸检验法的有关内容(见4.2.2);

——删除了前期检验唾液斑检验的有关内容(见2002年版的5.3);一删除了DNA提取PCR缓冲液处理法的有关内容(见2002年版的6.5);将有机溶剂法、Chelex法、硅珠法和CTAB法的器材、试剂和方法有关内容移入附录(见附录A,2002版的6.1、6.2、6.3和6.4);

——增加了DNA提取与纯化中的方法种类(见5.4、5.6、5.7、5.8、5.9、5.10、5.11、5.12和附录A);一删除了DNA质和量的检测定量胶检测法的有关内容(见2002年版的7.2);一删除了DNA质和量的检测人类DNA定量试剂盒的有关内容(见2002年版的7.3);一增加了DNA定量其他定量方法的有关内容(见6.3);

——删除了PCR反应的有关内容(见2002版的第8章);

——删除了反应产物的检测的有关内容(见2002版的第9章);

——增加了人类DNA性别及STR多态性分析的有关内容(见第7章);

——删除了防污染措施、文档资料、检验周期的有关内容(见2002版的第11章、第12章和第13章);

——增加了常用试剂推荐配方(见附录B)。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由全国刑事技术标准化技术委员会(SAC/TC179)提出并归口。

本标准主要起草单位:公安部物证鉴定中心。

本标准参加起草单位:上海市公安局、广州市公安局、北京市公安局、天津市公安局。

本标准起草人:叶健、周怀谷、刘超、赵兴春、陈松、刘雅诚、姜成涛、刘冰、匡金枝、张建、李彩霞、白雪。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为:

GA/T 383—2002。


法庭科学DNA实验室检验规范

1范  围

本标准规定了法庭科学DNA实验室检验应遵守的基本要求。

本标准适用于所有从事法庭科学检验的DNA实验室


2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 27025—2008 检测和校准实验室能力的通用要求

GA 765—2008 人血红蛋白检测金标试剂条法

GA 766—2008 人精液PSA检测 金标试剂条法


3 术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1 前期检验 priorexamination

DNA检验前进行的预试验和确证试验。

3.2 DNA提取DNAextraction

将DNA分子从其蛋白及其他细胞物质成分中分离提纯的过程和方法。

3.3 遗传标记 geneticmarker

由遗传决定,并能够以一定的规律从亲代传给子代的生物学特征。

3.4 聚合酶链反应polymerase chain reaction;PCR

一个酶促的特定DNA片段体外扩增过程。


4前期检验

4.1 血痕检验

4.1.1预检验

4.1.1.1联苯胺试验

4.1.1.1.1试剂

联苯胺试剂配方如下:

a)联苯胺无水乙醇饱和液;

b)3%过氧化氢溶液;

c)冰醋酸。

配制方法见附录B。

4.1.1.1.2方法

取滤纸轻轻擦拭斑迹,分别加冰醋酸、联苯胺无水乙醇饱和液、3%过氧化氢溶液,立即出现翠蓝色为阳性反应。

4.1.1.2 鲁米诺检验

4.1.1.2.1试剂

鲁米诺试剂配方为:

a)鲁米诺粉末;

b)过氧化氢粉末。

4.1.1.2.2方法

按1:5比例,分别将鲁米诺粉末0.1g与过氧化氢粉末0.5g置喷壶中,加入100mL~200mL蒸馏水混合,喷洒斑迹,立即出现蓝色荧光为阳性反应。

4.1.2确证检验——金标试纸检验法

4.1.2.1试剂

确证检验主要试剂如下:

a)人血红蛋白检测金标试纸条;

b)纯水。

4.1.2.2 方法

见GA 765—2008。

4.2 精斑检验

4.2.1确证检验——精子检出法

4.2.1.1试剂

确证检验主要试剂如下:

a)1%酸性复红溶液;

b)1%美蓝溶液;

c)1%盐酸;

d)生理盐水。

4.2.1.2方法

取少量可疑斑迹用适量生理盐水浸泡后,离心取沉渣涂于载玻片上,干燥后分别用1%酸性复红溶液和1%美蓝溶液染色,1%盐酸和清水洗涤,干燥后镜检。精子头部被染成红色,而尾部被染成蓝色。

4.2.2 确证检验——金标试纸检验法

4.2.2.1试剂

确证检验主要试剂如下:

a)人前列腺特异性抗原检测金标试纸条;

b)纯水。

4.2.2.2 方法

见GA 766—2008。


5DNA提取与纯化

详见附录A。

5.1 有机溶剂法

通过酚-氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质,保留DNA于水相溶液中的DNA提取方法。

5.2 聚苯乙烯二乙烯基苯树脂法

通过Chelex鳌合镁、钠和钾等离子,使降解DNA的核酸酶失去活性的DNA提取方法。

5.3 硅珠法

在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下,通过二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子的DNA提取方法。

5.4 磁珠法

在胍盐存在条件下,通过在硅胶外表涂上一层磁性树脂的磁珠,特异性的吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA的DNA提取与纯化方法。

5.5 十六烷基三甲基溴化胺法

通过非离子型去污剂CTAB破坏细胞壁和细胞膜及硬组织,并与DNA形成复合物,分离DNA与蛋白质及多糖类物质的DNA提取方法。

5.6 硅胶膜吸附法

通过硅胶膜吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA,并经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质以及多糖等杂质的DNA提取与纯化方法。

5.7 FTA卡法

通过FTA卡裂解细胞释放DNA,从血液、口腔上皮细胞中获得DNA的方法。

5.8 全自动工作站法

采用全自动工作站结合上述提取、纯化方法进行DNA提取和纯化的方法。

5.9 乙醇沉淀纯化法

通过乙醇沉淀去盐,纯化DNA的方法。

5.10 异丙醇沉淀纯化法

通过异丙醇去多糖、蛋白,纯化DNA的方法。

5.11 其他商品化核酸提取和纯化试剂盒

参照试剂盒说明书操作。

5.12 自行开发的核酸提取和纯化方法

应按照GB/T 27025—2008的要求进行方法确认。


6DNA定量

6.1 紫外分光光度计法

6.1.1预置分光光度计零点。

6.1.2充分混匀样品,读取260nm和280nm的OD值。

6.1.3计算A260/A280比率,比率大于1.6表明DNA较纯

6.1.4计算DNA浓度:

单链DNA:1OD=40μg/mL;

双链DNA:1OD=50μg/mL;

DNA浓度(μg/μL)=稀释倍数×A260×40μg/mL÷1000μL。

6.2 定量PCR仪定量

试剂和方法以说明书为准。

6.3其他定量方法

试剂和方法以说明书为准。


7人类DNA性别及STR(shorttandem repeats)多态性分析

7.1 器材及试剂

检验所用主要器材及试剂如下:

a)全自动荧光分析仪及配套试剂;

b)扩增仪;

c)移液器;

d)人类荧光标记STR复合扩增试剂盒(包括带有ABO分型及直接扩增)。

试剂配制方法见附录B。

7.2 方法

7.2.1人类荧光标记STR复合扩增试剂

7.2.1.1选用获得认证的商品化试剂盒或获得认证的直接扩增试剂盒。

7.2.1.2自行开发的试剂应按照GB/T27025—2008的要求经方法确认后方可使用于日常检案。

7.2.2 PCR扩增

7.2.2.1扩增反应体系及循环参数,以各试剂盒的说明书为准。

7.2.2.2设置阳性对照和阴性对照。

7.2.3 PCR反应产物的荧光检测

使用全自动荧光分析仪进行检测。器材、试剂、检测方法和数据分析以各试剂盒的说明书为准。


8人类线粒体DNA测序

人类线粒体DNA(mtDNA)的非编码区D环(D-Loop)含有两个变异率较高的高变区(High Variable Regions,HVR)I和IⅡ,本标准针对该两个区域HVRI和HVRII的测序,其他的DNA测序可参照本标准执行。

8.1 器材及试剂

检验所用主要器材及试剂如下:

a)全自动荧光分析仪及配套试剂;

b)扩增仪;

c)移液器;

d)PCR试剂:引物(D-Loop高变区I或高变区II)L1、H1、L2、H2(L2、H2的碱基序列范围比L1、H1小,并包含在L1、H1的范围内),dNTP,Taq酶,PCR缓冲液;

e)PCR产物纯化试剂盒;

F)测序试剂盒。

试剂配制方法见附录B。

8.2 方法

8.2.1样本DNA的扩增——Nested-PCR法

8.2.1.1 第一步扩增:25μL体系,取适量模板DNA,加入dNTP、引物L1和H1、PCR缓冲液、Taq酶,离心,PCR反应(反应参数根据具体引物的长度设定)。

8.2.1.2第二步扩增:50μL体系,取少量第一步扩增产物,加入dNTP、引物L2和H2、PCR缓冲液、Taq酶,离心,PCR反应(反应参数根据具体引物的长度设定)。

8.2.1.3 骨骼、毛干的测序从第一步开始,血液等富含DNA检材的测序从第二步开始。

8.2.2扩增产物的纯化

材料和方法以纯化试剂盒的说明书为准。

8.2.3 测序反应

材料和方法以测序试剂盒的说明书为准。

8.2.4荧光测序

使用全自动荧光分析仪进行测序,器材、试剂和方法以各说明书为准。

8.2.5结果分析

运用分析软件进行自动分析,以Anderson(1981)报道的线粒体DNA序列为标准序列,测得样本的碱基序列与其比对,得到该样本线粒体DNA高变区段碱基序列的特征,结合电泳图谱复核结果。

8.3 遗传学分析

线粒体DNAD-Loop区碱基序列为单倍型,进行遗传学数量分析时应依照单倍型基因频率统计进行计算。

计算公式:

式中:

X——线粒体DNA单倍型在群体中的频率;

P—一群体中任意两个体线粒体DNA多态区序列相同的可能性;

n——检测的样品数量;

h——单倍型多样性。

8.4 其他商品化检测试剂盒

参照试剂盒说明书操作。


·附录A

(规范性附录)

DNA的提取和纯化方法

A.1 有机溶剂法

A.1.1器材和试剂

主要器材及试剂如下:

a)高速离心机;

b)水浴或干浴;

c)移液器;

d)细胞溶解缓冲液;

e)蛋白溶解缓冲液;

f)DNA提取缓冲液;

g)TNE缓冲液;

h)TE缓冲液;

i)5×精子提取液;

j)纯化试剂盒(试剂和方法详见说明书);

k)CentriconTM-100;

l)SDS;

m)DTT;

n)饱和酚和氯仿;

o)无水乙醇和70%乙醇溶液;

p)NaCl或NaAc;

q)蛋白酶K。

A.1.2方法

A.1.2.1血液

A.1.2.1.1取适量血液加入等体积细胞溶解缓冲液,混匀至透明。

A.1.2.1.2离心后去上清液,沉淀中加入蛋白溶解缓冲液匀浆。

A.1.2.1.3 加入SDS和蛋白酶K,37℃消化4h以上。

A.1.2.1.4加入等体积的酚、酚和氯仿(1:1混合)、氯仿各提取一次后,加1/10体积的NaCl或NaAc溶液和2.5倍体积的冷无水乙醇混匀,得到团状的DNA沉淀。

A.1.2.1.5离心去上清液,沉淀中加入70%乙醇混匀。

A.1.2.1.6离心去上清液,晾干后加入TE缓冲液或纯水备用。

A.1.2.2混合斑

A.1.2.2.1 剪碎带有精子的检材,加入适量TNE缓冲液,37℃保温0.5h~1h,加入SDS和蛋白酶K,37℃保温2h左右消化女性上皮细胞。

A.1.2.2.2底部带孔离心管离心分离去除载体,并去除上清液,沉淀物用TNE洗涤离心数次。

A.1.2.2.3 沉淀物内加入5×精子提取液、蛋白酶K,置37℃消化3h~4h。

A.1.2.2.4 以下同A.1.2.1.4、A.1.2.1.5、A.1.2.1.6。

A.1.2.3 组织

A.1.2.3.1取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆。

A.1.2.3.2 加入SDS和蛋白酶K,37℃消化4h~6h。

A.1.2.3.3以下同A.1.2.1.4、A.1.2.1.5、A.1.2.1.6。

A.1.2.4 毛干

A.1.2.4.1 将毛干剪成3mm~5mm长,无水乙醇、纯水、无水乙醇各冲洗一次,晾干后加入DTT、SDS、蛋白酶K、蛋白溶解缓冲液,37℃消化至完全溶解。

A.1.2.4.2 加入等体积的酚、酚:氯仿(1:1混合)、氯仿各抽提一次,加入1/10体积的NaCl或NaAc溶液和2.5倍无水乙醇,混合后-20℃冷冻1h以上。

A.1.2.4.3 离心去上清液,沉淀中加入70%乙醇混匀。

A.1.2.4.4 离心去上清液,晾干后加入TE缓冲液或纯水备用。

A.1.2.5骨和牙齿

A.1.2.5.1 以手术刀刮净骨骼和牙齿表面垢物,用温热纯水冲洗两次,紫外光照射1h。再用锤子将牙齿砸成粉末和用电钻取骨密质和骨松质,并将其用研磨器进一步磨碎。

A.1.2.5.2 取适量骨或牙齿粉末,加入DNA提取缓冲液、蛋白酶K,于37℃消化过夜。

A.1.2.5.3 酚和氯仿提取,提取液置CentriconTM-100中离心浓缩后,加1/10体积的NaCl和2.5倍无水乙醇置-20℃冰箱过夜。

A.1.2.5.4离心去上清液,晾干加入TE缓冲液或纯水溶解,用纯化试剂盒纯化后备用。

A.2 Chelex

A.2.1器材和试剂

主要器材及试剂如下:

a)高速离心机;

b)水浴或干浴;

c)移液器;

d)Chelex-100;

e)TNE缓冲液;

f)蛋白酶K;

g)SDS;

h)DTT;

i)纯水。

A.2.2方法

A.2.2.1 血液和血痕

A.2.2.1.1取少量血液或血痕加入适量纯水,室温30min以上。

A.2.2.1.2离心后去上清液,沉淀中加入Chelex-100,56℃消化30min以上(干浴传热效果较水浴差,故采用干浴时,时间适当延长)。

A.2.2.1.3煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.2 混合斑

A.2.2.2.1 剪碎带有精子的检材,加入适量TNE缓冲液,37℃保温0.5h~1h,加入SDS和蛋白酶K,37℃保温2h左右消化女性上皮细胞。

A.2.2.2.2 底部带孔离心管离心分离去除载体,并去除上清液,沉淀物用TNE离心洗涤数次。

A.2.2.2.3 沉淀物内加入Chelex-100溶液、蛋白酶K和DTT溶液,置56℃消化2h左右。

A.2.2.2.4 煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.3 组织

A.2.2.3.1 取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆。

A.2.2.3.2 加入Chelex-100、蛋白酶K,56℃消化2h~3h。

A.2.2.3.3 煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.4唾液斑

A.2.2.4.1信封和邮票用灭菌的双蒸水润湿的棉签涂抹信封封口处和邮票背面,烟蒂直接剪取外层纸,剪碎后加入Chelex-100、蛋白酶K,56℃消化1.5h以上。

A.2.2.4.2煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.3组织

A.2.2.3.1取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆。

A.2.2.3.2加入Chelex-100、蛋白酶K,56℃消化2h~3h。

A.2.2.3.3煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.4睡液斑

A.2.2.4.1 信封和邮票用灭菌的双蒸水润湿的棉签涂抹信封封口处和邮票背面,烟蒂直接剪取外层纸,剪碎后加入Chelex-100、蛋白酶K,56℃消化1.5h以上。

A.2.2.4.2煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.5毛发

A.2.2.5.1毛根剪取毛发的毛根部分5mm~10mm,毛于则剪成3mm~5mm长,无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次,晾干后加入Chelex-100、蛋白酶K、DTT,56℃消化至完全溶解。

A.2.2.5.2煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.6骨和牙齿

A.2.2.6.1研碎的牙髓或骨髓,加入Chelex-100、蛋白酶K溶液,56℃消化过夜。

A.2.2.6.2煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.3 硅珠法

A.3.1器材和试剂

主要器材及试剂如下:

a)高速离心机;

b)水浴或干浴;

c)移液器;

d)吸附液;

e)漂洗液;

f)硅珠悬液;

g)TES缓冲液;

h)十二烷基肌氨酸钠;

i)SDS;

j)DTT;

k)蛋白酶K;

1)无水乙醇和70%乙醇;

m)双蒸馏水。

A.3.2方法

A.3.2.1血液和血痕

A.3.2.1.1取少量血液和血痕,加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠,煮沸5min以上,血痕离心去载体。

A.3.2.1.2加入吸附液,混和后加入硅珠悬液,混和后室温15min左右。

A.3.2.1.3离心去上清液,加入漂洗液,混合。

A.3.2.1.4离心去上清液,加入冷70%乙醇,混合。

A.3.2.1.5离心去上清液,加入TES,56℃保温10min以上。

A.3.2.1.6离心后置4℃冰箱内保存备用。

A.3.2.2混合斑

A.3.2.2.1剪碎带有精子的检材,加入适量TES缓冲液、SDS和蛋白酶K溶液,37℃消化2h左右。

A.3.2.2.2去载体,离心去上清液,TES缓冲液洗涤沉淀物数次。

A.3.2.2.3加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠,煮沸5min以上。

A.3.2.2.4  离心后上清液按A.3.2.1.2~A.3.2.1.6操作进行。

A.3.2.3毛发和指(趾)甲

A.3.2.3.1毛发或指(趾)甲分别用双蒸馏水和无水乙醇洗涤,剪碎后加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和DTT溶液,56℃消化至完全溶解。

A.3.2.3.2离心后上清液按A.3.2.1.2~A.3.2.1.6操作进行。

A.3.2.4骨和牙齿

A.3.2.4.1取适量骨或牙齿粉末(见有机溶剂提取法)分别用TES缓冲液和EDTA洗涤,加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和蛋白酶K、DTT溶液,56℃消化过夜。

A.3.2.4.2离心后上清液按A.3.2.1.2~A.3.2.1.6操作进行。

A.4 磁珠法

A.4.1器材和试剂主要器材及试剂如下:

a)磁架;

b)旋涡振荡器;

c)干浴或水浴;

d)移液器;

e)磁珠试剂盒(试剂和方法详见说明书);

f)纯水。

A.4.2方法

A.4.2.1取适量检材,加入适量裂解液95℃~100℃ 30min以上。

A.4.2.2去除载体,加入磁珠液,混合,室温5min左右。

A.4.2.3旋涡振荡后置磁架上,去液体。

A.4.2.4裂解液洗涤后置磁架上,去液体,重复3次左右。

A.4.2.5室温下空气干燥5min~10min,加适量纯水,65℃5min左右。

A.4.2.6混合后置磁架,将DNA溶液吸出备用。

A.5 CTAB

A.5.1器材和试剂

主要器材及试剂如下:

a)高速离心机;

b)水浴或干浴;

c)移液器;

d)CTAB提取缓冲液;

e)氯仿/异戊醇(24:1);

f)MicroconTM-100;

g)纯化试剂盒(试剂和方法详见说明书);

h)纯水。

A.5.2方法

A.5.2.1取适量骨或牙齿粉末(见有机溶剂提取法),加入CTAB提取缓冲液,室温过夜。

A.5.2.2 65℃保温1h以上,离心后保留上清液,加入等体积的氯仿/异戊醇,离心后保留上清液。

A.5.2.3上清液加入MicroconTM-100中,离心浓缩。

A.5.2.4浓缩液进行纯化,纯化试剂和方法以说明书为准。

A.6 硅胶膜吸附法

A.6.1器材和试剂

主要器材及试剂如下:

a)高速离心机;

b)水浴或干浴;

c)移液器;

d)硅胶膜试剂盒(试剂和方法详见说明书);

e)无水乙醇;

f)纯水。

A.6.2方法

A.6.2.1取适量检材,加入适量裂解液85℃10min以上。

A.6.2.2加蛋白酶K,混合,56℃保温1h以上。

A.6.2.3过硅胶膜柱纯化。

A.6.2.4加纯水洗脱,洗脱液备用。

A.7 FTA卡法

A.7.1器材和试剂

主要器材及试剂如下:

a)高速离心机;

b)移液器;

c)纯水。

A.7.2方法

A.7.2.1从FTA卡样品区剪取适量血斑,加入纯水,浸泡5min左右,去浸泡液,重复两次。

A.7.2.2干燥待用。

A.8 全自动工作站法

器材、试剂和方法以说明书为准。

A.9 乙醇沉淀纯化法

A.9.1器材和试剂

主要器材及试剂如下:

a)高速离心机;

b)移液器;

c)10mol/L醋酸胺溶液;

d)无水乙醇和70%乙醇;

e)纯水。

A.9.2方法

A.9.2.1在DNA溶液中加入0.2倍体积10mol/L醋酸胺溶液和2倍体积冷的无水乙醇。

A.9.2.2离心,去上清液。

A.9.2.3 70%乙醇洗涤沉淀2次,离心收集沉淀。

A.9.2.4加入适量纯水或TE溶液,置4℃冰箱内低温保存备用。

A.10 异丙醇沉淀纯化法

A.10.1器材和试剂

主要器材及试剂如下:

a)高速离心机;

b)移液器;

c)66.7%异丙醇和75%异丙醇;

d)纯水。

A.10.2.1在DNA溶液中加入9倍体积66.7%异丙醇。

A.10.2.2离心,去上清液。

A.10.2.3加入75%异丙醇,混合,离心,去上清液。

A.10.2.4干燥后,加入适量纯水,置4℃冰箱内低温保存备用。


·附录B

(规范性附录)

常用试剂推荐配方

B.1 联苯胺试剂

B.1.1联苯胺无水乙醇饱和液(50mL)加冰醋酸5滴~6滴。

B.1.2 3%过氧化氢(30%过氧化氢1mL加纯水9mL)。

B.2 细胞溶解缓冲液(CLB)

0.64mol/L蔗糖,0.01mol/LMgCl2,0.02mol/LTris-HCl(pH7.6),2% TritonX-100。

B.3 蛋白溶解缓冲液(PLB)

75mmol/L NaCl,24mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)。

B.4 DNA提取缓冲液

10mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,2%SDS,39 mmol/L DTT。

B.5 TNE缓冲液

10 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/LEDTA(pH8.0),100 mol/L NaCl。

B.6 TE缓冲液

10mmol/L Tris-HCl(pH7.5),1mmol/L EDTA。

B.7 5x精子提取液

50mmol/LTis-HCl,50 mmol/LEDTA(pH8.0),500mmol/L NaCl,10%SDS溶液,0.5mol/L DTT。

B.8 硅珠法吸附液

12g硫氰酸胍、10mL0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)、0.8mL0.5 mol/L EDTA、0.5mL Triton X-100。

B.9 硅珠法漂洗液

12g硫氰酸胍、10mL0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)。

B.10 硅珠悬液

0.06g二氧化硅、1mL纯水。

B.11 TES缓冲液

1mL 1mol/LTris(pH8.0)、2mL 5 mol/L NaCl、2 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)、95mL纯水。

B.12 CTAB提取缓冲液

20gCTAB(十六烷基三甲基溴化胺)、1mol/LTris-HCl(pH8.0)100mL、0.5 mol/L EDTA(pH8.0)40mL、NaCl81.82g,定容至1L,使用前加入4mL2-巯基乙醇。


戴卫祥 律师

戴卫祥,男,辽宁东亚律师事务所合伙人,三级律师,工学、法学学士学位。现任辽宁省律师协会政府法律顾问专业委员会委员、辽宁省省级人民监督员,大连市律师协会房地产与建设工程法律专业委员会副主任,大连市司法局法律顾问。

2001年从事法律工作,具有多年工作经验、律师执业经验及4年工程建设现场管理经验,先后担任恒大集团大连公司、辽宁公司监察室主任。执业以来,代理过建设工程鉴定、刑事鉴定、机动车交通事故鉴定、医疗损害及医疗产品质量鉴定、消防工程鉴定、环境损害鉴定等各类司法鉴定案件,积累了丰富的司法鉴定办案经验,并成功代理过多起通过司法鉴定确定无罪的刑事、司法鉴定行政确认等案件,在司法鉴定专业有深入、系统的研究和实践。

执业期间,秉承“忠实、勤勉、认真、专业”的执业理念,为多家企业及个人办理几百起成功案件,以认真细致地专业服务,赢得了当事人的一致认可和信赖。


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