数据说话！深扒第一个新型冠状病毒潜在抗体药物！

康复期血清疗法 (convalescence-phase plasma therapy) 是一种很经典的治疗方案，就是把已经康复的病人血清提取出来，本质上就是抗病毒的抗体，作为药物再注射到其他病人的体内。例如中和抗体mAb114于2019年5月被美国FDA授予突破性药物资格，将埃博拉病毒感染的致死率从67%降到11%；考虑新型冠状病毒2019-nCoV与SARS-CoV的基因比较相近，那么可以中和SARS-CoV的抗体是不是也可以中和2019-nCoV呢？考虑新型冠状病毒2019-nCoV与SARS-CoV的基因比较相近，那么可以中和SARS-CoV的抗体是不是也可以中和2019-nCoV呢？目前2019-nCoV新型冠状病毒在中华大地施虐，各个科研机构开足了马力在筛选药物和研发疫苗。复旦大学基础医学院的应天雷课题组在1月28日发表了预印版文章^【1】通过实验证明了从原先SARS病人体内提取的一株抗体可能是针对新型冠状病毒的潜在药物。

靶点蛋白制备与检测

作者选取的靶点是2019-nCoV 的S蛋白的RBD结构域（刺突蛋白的受体结合结构域，下面简称S-RBD），这个是针对冠状病毒疫苗和药物最热的靶点。一个潜在药物必须验证其与靶点的亲和力，首先需要获得靶点蛋白。2019-nCoV基因序列在1月10日公布，并发现2019-nCoV的受体和SARS-CoV一样是ACE2^【2】。

然后作者马上委托公司合成靶点S-RBD基因序列；通过HEK293真核表达系统表达（S蛋白是糖蛋白，存在翻译后修饰，用真核表达比较保险），并融合了Avi-tag标签和HIS标签；用镍柱进行纯化后，用SDS-PAGE和A280分别鉴定纯度和浓度。

在生物膜干涉技术（BLI）检测中，因为有Avi-tag，可以体外用生物素化连接酶对S-RBD进行生物素化，然后固化在链霉亲和素传感器上。这种生物素化为定向生物素化，只在末端带一个生物素，可以最大程度的保持蛋白活性。

为了检测S-RBD的活性，用BLI技术（Octet RED96相互作用仪）检测靶点与受体ACE2的亲和力（如下左图），并和之前报道的SARS-CoV的S-RBD和ACE2的亲和力（如下右图）进行对比^【3】。

左图：2019-nCoV的S-RBD与ACE2亲和力检测（BLI法） 右图：SARS的S1蛋白与ACE2亲和力检测（BLI法）

2019-nCoV的S-RBD与ACE2的亲和力在十几个nM级别，和之前报道的同样用BLI检测的SARS的S1蛋白与ACE2的亲和力差不多。

这个数据不仅说明靶点蛋白具有良好的活性，而且第一次检测到了2019-nCoV和受体的亲和力，意义也非常重大。S蛋白与受体的结合是病毒侵染人体非常重要的一步。一般来说，病菌与宿主受体的亲和力越强，宿主越容易感染病菌。如果2019-nCoV的S-RBD与受体的亲和力和SARS相似，是不是意味着两者的易感性一样呢？

但是陈老师认为，虽然两个数据都是BLI法测试的，并且使用了同样的表达系统获得S蛋白，但是实验有几点不一样：

1

蛋白来源的融合标签不一样，右图是Fc融合，左图是生物素化；

2

所用的固化方式不一样，右图是氨基偶联，左图是链霉亲和素；

3

实验的缓冲液也不一样，右图是pH8.0的缓冲液，左图的未透露，只说是PBST，一般为pH7.4。

所以两种冠状病毒的S蛋白与ACE2的亲和力是否一致，还需要进一步鉴定，至少需要在同样实验条件下进行测定。

潜在药物抗体的亲和力

本文选取了三个SARS-CoV和一个MERS-CoV的抗体，分别针对SARS-CoV和MERS-CoV S RBD蛋白的抗体，并检测它们与S-RBD的结合力。这些抗体已经证明具有中和SARS-CoV和MERS-CoV的能力。本文用BLI技术检测这些抗体与S-RBD的亲和力，将S-RBD固化在链霉亲和素传感器上，与不同浓度的抗体进行结合解离，结果如下图所示：

几种抗体与2019-nCoV S-RBD蛋白的亲和力检测

几个抗体中只有CR3022可以结合2019-nCoV，这个抗体来自于SARS康复病人血清，其他抗体没有结合或者结合很弱。另外，BLI结果与ELISA结果非常相似。

ELISA结果表明CR3022结合能力最强

潜在药物不能阻断ACE2与靶点的结合

作者还做了受体竞争实验，固化S-RBD蛋白，然后依次与ACE2 和CR3022结合。如果CR3022仍然有结合信号，说明CR3022与ACE2不是竞争结合S-RBD的。考虑到ACE2与S-RBD的解离比较快，所以在第二步抗体结合时，加入了同样浓度的ACE2。

受体竞争实验（BLI法，OCTET RED96）

从上图可以获知，ACE2与CR3022不竞争结合S-RBD。可能意味CR3022联用其他阻断抗体效果更好。但是考虑到CR3022对SARS-CoV的中和活性^【4】以及与2019-nCoV S-RBD的较高亲和力，这个抗体也算是一个潜在药物。

讨论

这篇文章数据只能说明这个药物是非常潜在的药物，至少还要通过病毒中和实验才能进一步证明，还有后续的动物实验，临床实验等。

不过考虑到从1月10日2019-nCoV的基因序列公布，到1月24日前完成所有实验，这个课题组在两个星期内获得这些成果可以说是光速了。陈老湿根据经验和文章提供的信息预估了作者的时间节点。

预估每个步骤的时间节点

文章的主要数据（BLI和ELISA实验）仅花了一两天的时间完成。没有加班加点的拼搏，没有长时间的技术积累，没有各个单位的配合，这个课题组在短时间内是无论如何都完成不了这些工作的。

这也是奋战在抗击新型肺炎一线工作的同志们的缩影，我们相信在各个科研人员的不分日夜的工作下，新型冠状病毒肺炎的药物或者疫苗会马上到来！再次向奋战在一线的科研工作者致敬！

参考文献：

1. Potent binding of 2019 novel coronavirus 1 spike protein by a SARS coronavirus-specific human monoclonal antibody. Jan. 28, 2020; doi: http://dx.doi.org/10.1101/2020.01.28.923011

2. Shi Z-L, Zhou P, Yang X-L, et al. Discovery of a novel coronavirus associated with the recent

pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin. bioRxiv. 2020:2020.01.22.914952.

3. Walls AC, Xiong X, Park Y-J, et al. Unexpected receptor functional mimicry elucidates

activation of coronavirus fusion. Cell. 2019;176(5):1026-1039. e15

4. Ter Meulen J, Van Den Brink EN, Poon LL, et al. Human monoclonal antibody combination

against SARS coronavirus: synergy and coverage of escape mutants. PLoS medicine.2006;3(7).

相关阅读：