用于表征肠道微生物群的技术：临床医生指南（综述节选）
Techniquesused to characterize the gut microbiota: a guide for the clinician
Nat RevGastroenterol Hepatol（2012）
DOI 10.1038/nrgastro.2012.44.
Abstract
The gut microbiota is a complexecosystem that has a symbiotic relationship with its host.An association between the gut microbiota and disease was first postulated in the early 20th century.However,until the 1990s,knowledge of the gut microbiota was limited because bacteriological culture wasthe only technique available to characterize its composition.Only a fraction(estimated at<30%)of the gut microbiota has been cultured to date.Sincethe 1990s, advances in culture-independent techniques have spearheaded ourknowledge of the complexity of this ecosystem.These techniques have elucidatedthe microbial diversity of the gut microbiota and have shown that alterationsin the gut microbiota composition and function are associated with certain disease states,suchas IBD and obesity.These new techniques are fast, facilitate high throughput,identify organisms that are uncultured to date and enable enumeration oforganisms present in the gut microbiota.This Review discusses the techniquesthat can used to characterize the gut microbiota, when they can be applied tohuman studies and their relative advantages and limitations.
肠道菌群是一个复杂的生态系统，与宿主具有共生关系。肠道菌群与疾病之间的联系最早是在20世纪初提出的。然而，直到20世纪90年代，肠道微生物群的知识一直受到限制，因为细菌学培养是唯一可用于表征其组成的技术，迄今只培养了一小部分（估计<30%）的肠道微生物群。自20 世纪90年代以来，独立于细菌培养技术的进步引领了我们对这一生态系统复杂性的认识。这些技术已经阐明了肠道微生物群的微生物多样性，并表明肠道微生物群组成和功能的改变与某些疾病状态有关，如 IBD 和肥胖。这些新技术速度快，有利于高通量鉴定迄今为止未培养的生物体，并能够计数存在于肠道微生物群中的生物体。这篇综述讨论了可用于表征肠道微生物群的技术，并分析了其应用于人类研究的相对优势和局限性。
背景简介
人类肠道微生物群是一个复杂的生态系统，由与人类宿主有共生关系的多样化的原核生物群体（和可变的少数真核生物）组成。微生物对宿主的生理、免疫和营养状态都有相当大的影响。七个门构成肠道微生物群的主体，即厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、疣状微菌门(Verrucomicrobia)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。厚壁菌门和拟杆菌门容纳的物种最丰富，并构成超过 90% 的人类肠道微生物群。
自 20 世纪 90 年代以来，人们对人类肠道微生物群在疾病中的作用越来越感兴趣。早在 1907 年 Metchnikoff 假设用乳酸菌替代或减少肠道中的腐败菌可以使肠道健康正常化并延长生命时，就提出了这种关联。最新研究结果强烈表明，微生态失调（改变微生物群的组成）有助于肠易激综合征（IBS）、肠癌、肥胖症和 1 型糖尿病等多种疾病的发生。此外，已发现厚壁菌门可减少克罗恩病的群落复杂性。
我们对肠道微生物群的了解，它如何与宿主相互作用，以及它是如何引起人类疾病的，得益于系统发育的调查和独立于培养物的定量技术的进步。对整个肠道微生物群的全面了解将是了解肠道微生物群与疾病之间关系的关键。培养和生化分型是多年来鉴定菌种的金标准。然而，自 20 世纪 90 年代以来，独立于培养和生化分型的技术已经彻底改变了我们对肠道微生物群的认识，因为它们能够为这个小生境提供更具代表性的快照。这些技术是基于小亚基核糖体 RNA (16S rRNA) 的序列差异，并能够证明如下：第一，肠道微生物群的微生物多样性；第二，细菌种类的定性和定量信息；第三，肠道微生物群与疾病有关的变化。这些技术有变性梯度凝胶电泳 (DGGE)、末端限制性片段长度多态性 (T-RFLP)、荧光原位杂交 (FISH)、DNA 微阵列和 16SrRNA 基因或扩增子的新一代测序。
由于各种疾病和疾病都需要分析微生物群在其病因中的潜在作用，临床医生和临床研究者可能会对研究微生物群的分子微生物学方法有所困惑，他们可能很难确定一个给定的方法用来解决一个特定的研究问题是否合适。因此，这篇综述介绍了目前用于表征肠道微生物群的技术。我们解释了从肠道微生物菌群培养到微生物组鸟枪法测序的各种技术，分析了这些技术何时可以最恰当地应用于人类研究，并批判性地回顾了它们的优点和局限性 (表1，图1)。
Figure 1.Overview of techniques used to characterize the gut microbiota.
图1. 描述肠道微生物群特征的技术概述。
菌群培养技术
直到 20 世纪 90 年代，肠道微生物群的知识还仅限于基于培养的技术，这种方法从 20 世纪初就开始使用。此后，根据菌株的发酵特征和体外生长要求，在菌株的表型分型方面取得了进展。尽管通过培养进行细菌鉴定相当便宜，但它是劳动密集型的，单凭培养就对肠道微生物群的多样性提供了有限的观点，因为迄今培养的肠道微生物群成员小于30 %。重要的是，肠道微生物群中未培养的生物不一定是不可培养的。事实上，它们可能是可培养的，但尚未开发或发现这些生物的许可生长条件。
与独立于菌群培养技术的发展同时，通过使用例如凝胶微滴和微生物培养芯片（微培养皿），培养技术变得更加复杂。这些技术是高通量的，能够培养以前未培养的生物。然而，一些肠道微生物群元素彼此之间具有共生关系，因此这类生物依赖于其他生物的代谢活动来生长，因此限制了新的纯培养技术的有用性。
16S rRNA
70S 核糖体分散在一个细菌细胞的整个细胞质中，它们由两个亚基组成：30S 和 50S。50S 亚基包含两个 RNA 分子：5S 和 23S。30S 亚基（或小亚基）含有一个 RNA 分子：16S 核糖体 rRNA(16S rRNA)（图 2）。16S rRNA 的功能之一是蛋白质合成的起始和延伸。由于 rRNA（5S，16S 和 23S）在细菌物种间高度保守，但含有产生系统发育信号的可变区，因此它是系统发育鉴定（细菌鉴定）的有用靶标。在 3 个细菌 rRNA 基因中，16SrRNA 基因为 PCR 引物和充当进化计时器的可变区提供了最易处理的保守位点组合，因此，它通常优先于 5S 或 23S rRNA 基因用于系统发育鉴定。因此，大多数（但不是全部）用于分析肠道微生物群的当代不依赖菌群培养的技术是基于对 16S rRNA 基因的分析。
Figure 2. 70S RNA.
图2. 70S RNA.
PCR
虽然 PCR 在医学领域是一个巨大的技术进步，但它有局限性；从取回样品到产生的 16SrRNA 扩增子的每一个物理、化学和生物学步骤都代表了潜在的偏倚来源（图 3）。例如，微生物细胞的差异性裂解可影响最终的表观微生物群组成；革兰氏阳性生物通常需要严格的条件来裂解细菌细胞壁（这比革兰氏阴性细菌中的厚），而这些相同的条件可能导致革兰氏阴性染色体 DNA 的过度断裂。PCR 的另一个主要限制是引物的设计必须针对所有的门。
图3. 核酸的提取和 16SrRNA 基因的扩增。将粪便样品分散在缓冲液中，通过振摇（用微珠）机械破碎细胞。脂质和蛋白质通过加入去污剂和蛋白酶去除。乙醇的加入导致 DNA 的沉淀和聚集，离心后形成沉淀。下一步是通过 PCR 扩增 16S rRNA 基因（样本中存在的所有靶基因，作为混合群体）。高温使双链 DNA 模板分离，与 16S rRNA 基因保守区互补的通用引物退火，DNA 聚合酶产生新的双链 DNA 片段。多次重复该循环导致粪便细菌群落中所有 16S rRNA 基因的指数扩增。扩增的 16S rRNA 基因制品称为 16S rRNA 基因扩增子。缩写：rRNA，核糖体 RNA。
单独的 PCR 对于定量样品中存在的 DNA 是不可靠的；定量 PCR (qPCR)，也称为实时 PCR，不仅可以扩增 DNA，还可以可靠地定量存在的 DNA 量。使用的技术与上述标准 PCR 的技术相似，但反应混合物含有一种化合物，当它与双链 DNA 即 PCR 产物结合时会发出荧光。通过使用对数标度将测试样品中的荧光水平与 PCR 循环数作图，可以通过参考从已知目标拷贝数的平行扩增得到的标准曲线来定量测试样品中存在的 DNA 量。信号强度与样品中存在的 DNA 量成正比。候选引物可设计为针对所有细菌门（例如，如果需要了解总细菌负荷），或单个门或物种。
qPCR 可单独使用，也可与其他技术联合使用。单独使用 qPCR 对肠道微生物群的研究已经证实了与患者年龄、抗生素使用和疾病状态有关的变化（例如，克罗恩病）。一些用于表征肠道微生物群的分子技术（例如 DGGE 或 DNA 微阵列）是半定量的（见下文），因此，对于肠道微生物群组分的数值评估不是最佳的。当 qPCR 与这些技术结合使用时，它可以提供关于肠道微生物群多样性和丰度的更详细信息。例如 Zwielehner et al使用 DGGE 和 qPCR 比较了养老院老年患者和年轻健康志愿者的肠道微生物群。研究人员证明，与年轻健康志愿者相比，养老院老年人的细菌丰度和细菌总多样性较少。
qPCR 的优点包括系统发生鉴别、速度和设计针对特定物种的引物的固有能力；它是对总微生物负荷最准确的独立于培养物的测量。此外，qPCR 试剂盒在市场上广泛销售，可供无法使用所述其他技术的实验室使用。缺点包括 PCR偏倚的可能性，除非广泛的先验分析显示对于给定的目标引物组合不会发生，并且无法鉴定新物种。这项技术也可能是劳动密集型和技术上具有挑战性的（例如，引物设计）。
指纹技术
DGGE 和 TGGE
DNA 指纹技术是一种群落分析工具，可以比较样本中的 DNA 片段。DGGE 分离 16S rRNA 基因扩增子的复杂混合物（例如，来自粪便样品的扩增子），其长度相同但 DNA 序列不同。
将 16S rRNA 基因扩增子混合物直接作用于含有线性递增梯度变性剂（甲酰胺和/或尿素）的聚丙烯酰胺凝胶上。当施加电泳电流时，16S rRNA 基因扩增子沿着凝胶向下迁移。最初，片段根据其分子量单独移动，但随着暴露于变性剂的增加，DNA 链开始变性。当它们几乎完全变性时，迁移停止。DNA 序列变异导致不同的解链温度；迁移在变性梯度的不同位置停止，导致片段分离和条带形成。由于物种之间存在序列变异，物种分离是可能的。将凝胶染色以允许条带可视化，然后可以切除条带进行测序或探针杂交。该过程允许从混合样品中分离多个 16S 物种。
DGGE 主要用于比较目的；例如，将一种疾病与另一种疾病或健康状态进行比较。这种技术速度快，可以同时分析多个样品。这种技术（连同 TGGE，T-RFLP 和 FISH）有时被认为是定量的，因为它给出了条带和/或物种强度和丰度的视觉印象。然而，严格来说，这些技术充其量是半定量的，因为变化的放大动力学使得精确的定量比较是不可取的。缺点包括 PCR 偏倚和缺乏直接的系统发育鉴定，除非进行测序或探针杂交。TGGE 也被用于肠道微生物群的研究，其工作方式与 DGGE 类似，但使用线性温度梯度代替变性梯度凝胶。
种属鉴定
探针杂交
探针杂交技术是基于特定寡核苷酸探针与细菌 DNA 上靶序列的杂交。寡核苷酸探针与特定的分类群和/或物种互补。这些技术包括 FISH 和 DNA 微阵列。探针杂交的主要用途是对存在的物种进行系统发育鉴定和定量。
测序
测序是分类学鉴定到物种水平的金标准，但这种方法需要来自全长 16S rRNA 基因（>1,500 个碱基对长）的信息，这些基因只能从克隆文库插入片段实际测序。一旦通过下述技术确定序列，将其与数据库进行比较，例如，GenBank® [US Department of Health and Human Services, Bethesda, MD,USA], 该数据库包含超过380,000 个生物体的核苷酸序列。专门为核糖体 RNA 基因开发的专家数据库正被越来越多地使用，如核糖体数据库项目。如果全长 16S rRNA 基因已被测序，则将序列与数据库进行比较可鉴定该生物体。通常使用0.5-1% 的序列差异范围来描述物种分类学等级，尽管也使用实用的 97 分界点来定义操作分类单位。测序可以直接在 16S rRNA 扩增子上进行，也可以通过从凝胶中切除条带（使用 DGGE，TGGE 或 T-RFLP），再扩增通过PCR 切除的条带。Sanger 测序直到 20 世纪 90 年代才被广泛使用，但对低成本和高产出测序的需求导致了所谓的下一代测序技术的发展。
下一代测序
下一代测序技术描述了以低成本和快速的速度提供序列数据的测序技术。市售技术包括 454 焦磷酸测序® (Roche Diagnostics GMBHLtd，Mannheim，Germany)，Illumina® (Illumina，SanDiego，CA，USA) 和 SOLiDTM (Life technologies，Carlsbad，CA，USA)。这些下一代方法通常不适用于克隆扩增子，而是直接扩增子 DNA 或总群落 DNA。
16S rRNA 基因扩增子的直接测序
部分 16S rRNA 基因扩增子的大规模平行测序使用珠子（454 焦磷酸测序® ）、载玻片(Illumina® )和固体表面 (SOLiDTM)，被描述为大规模并行测序，因为大量的 DNA 模板可以并行测序，也就是说，在相同的时间和相同的反应设置（图 8）。焦磷酸测序可以在一次运行中以 99 或更高的准确度测序 5 亿个碱基。它比 Sanger 测序的通量增加了大约 2,000 倍。由于读取的序列较短（大约是 Sanger 测序产生的读长的一半），可以读取更多的序列，因此可以检测到低丰度的细菌。根据系统发育型发现研究的结果，在微生物群研究中常规产生 20,000-40,000 个454钛读数，每个受试者约 400 个核苷酸。该技术的其他优点包括：系统发育鉴定，未知细菌的检测和/或鉴定，速度，以及收集定量数据的能力。大规模平行测序的成本适中，估计需要 5,000 美元才能将一个新的微生物基因组测序到高标准，而将一个参考基因组可用的物种的基因组测序的成本低于 500 美元。454 焦磷酸测序的主要用途是比较不同状态之间的肠道微生物群，例如，瘦与肥胖，也检测抗生素对肠道微生物群的影响；然而，更多的应用是可能是使用 454 焦磷酸测序比较IBS 患者和健康人。研究发现 IBS 患者的肠道微生物群形成了两个集群；那些微生物群异常（一种增加的厚壁菌门：拟杆菌比率）的患者和那些微生物群正常的患者（类似于健康对照）。有趣的是，那些具有正常微生物群的IBS患者在临床上表现出显著的抑郁和/或焦虑。作者的结论是，这一发现需要证实和进一步分析；然而，这项研究强调了下一代测序不仅在理解 IBS 的病理生理学，而且在理解其他疾病的应用潜力。
Figure8 | 454pyrosequencing® .
图 8. 454 焦磷酸测序® 。
微生物组鸟枪法测序和宏基因组学
尽管 16S rRNA 技术的使用极大地推进了我们对肠道微生物群组成的理解，并使得能够在健康和各种疾病之间进行比较，但它还没有回答最重要的问题，即给定的微生物模式和疾病状态之间的关联的生物学或临床意义。宏基因组学（也称为环境基因组学或社区基因组学；Box 1）代表了肠道微生物群分析的最新发展，能够解决这个问题。宏基因组学技术最早是由 Handelsman 在 1998 年将其用于土壤微生物群的研究时描述的。自那时以来，宏基因组学已被用于研究，包括人类微生物组计划（HMP；由 NIH 资助）、全球海洋取样考察以及肠道微生物群的研究。该技术的独特之处在于，对样本中所有 DNA 片段的代表性样本进行测序，而不是对特定 DNA 片段进行测序。
微生物组鸟枪法测序因此涉及整个群落 DNA 的鸟枪法测序；这是通过混合 DNA 样品的大规模平行测序完成的。鸟枪法测序，顾名思义，涉及 DNA 的随机片段化，DNA 片段的测序和重叠序列的重构，将它们组装成一个连续的序列。
微生物组鸟枪法测序的优势在于收集关于肠道微生物群的遗传多样性和功能的数据，其他技术仅分析肠道微生物群的遗传多样性。关于肠道微生物群的遗传多样性和功能的信息允许在该器官与健康和患病状态之间建立相关性。微生物组鸟枪法测序的局限性在于其价格昂贵，而且对生成的大量数据的分析计算量大，在非专业实验室中还不容易进行。
人类胃肠道的宏基因组学在 2006 年Breitbart 等首次被描述，作者从人类粪便中鉴定了大约 1 200 种病毒基因型。Manichanh 等是第一个使用宏基因组学方法对来自肠道微生物群的克隆片段进行测序的组。比较健康志愿者和克罗恩病患者的混合粪便样本，结果显示克罗恩病患者粪便微生物群中厚壁菌门的群落复杂性降低。HMP 是 NIH 主导的一项倡议，旨在描述人类5 个主要部位的微生物群体（鼻腔和口腔、胃肠道和泌尿生殖道以及皮肤）的特征，并分析这些微生物在人类健康和疾病中的作用。
除宏基因组学外，还有其他研究代谢物、蛋白质和 RNA 的组学方法 (Box 1)。通过组装这些方法，我们将对肠道微生物群的功能有更多的了解。
使用哪种方法以及何时使用
在设计评估肠道微生物群的研究时，在决定使用哪种技术时，必须考虑所需的成本和分析深度。DGGE 是一种快速评估肠道微生物群组成的有用技术，特别适用于多个样品的首过比较。如果要设计新的检测方法来检测特征较差的细菌种类，那么 qPCR 可能具有挑战性，但对于已知的人类肠道微生物群的重要组成，qPCR提供了有效的检测方法，并且总细菌量也很容易测量。FISH 也可用于此目的，由于其目标探针可用于特定的门或物种。16s RNA基因测序使得用户将在门和属水平获得微生物群的组成分析，并将能够比较几十个样本。其他下一代方法目前仍然更适合对少量样本进行深度鸟枪法测序。
结论
独立于菌群培养的技术可以是定量的、定性的，也可以是两者兼而有之。所描述的每种技术对肠道微生物群的研究都有不同的应用。大多数技术都基于 16S rRNA 基因的序列分析，由于该基因足够保守以允许扩增，但同时具有足够的差异性以提供系统遗传信号。
最新的独立于菌群培养的技术包括下一代测序和微生物组鸟枪法测序。这些技术的优点是它们具有高通量，系统发生地表征微生物群的组成，并量化存在的生物体的相对比例。虽然它们仍然有些昂贵，但这些方法的成本正在下降。通过对肠道微生物群进行鸟枪法测序实现的宏基因组学提供了最强大的数据，包括对微生物群功能的预测，但生物信息学令人望而生畏。随着我们对肠道微生物群多样性的理解以及这种超级器官与人类宿主之间相互作用的扩大，宏基因组学有可能进一步推进这一领域，从而提高我们对各种疾病过程的理解。疾病预防和管理的新策略可能会被揭示。
【声明】
本译文的原文作者以及其他相关信息已经在相关位置明确说明。
原文以及本译文的全部知识产权仅归原作者以及原文出版机构所有。
知几未来研究院仅为自身学习、研究、交流为目的进行试翻译，仅供科研使用，不用于任何商业用途。若本译文侵犯任何主体的知识产权或其他权益，请速通过公众号留言联系我们，我们将尽快处理。
任何主体使用本译文，应仔细阅读并知晓上述事宜，我方对任何主体使用本译文的行为不承担任何责任。
知几未来研究院正在搭建一个“疾病-肠道菌群”知识库。
你可以在公众号菜单栏“学术工具“板块直接查阅疾病和肠道菌群的相关信息；
也可以在公众号对话框回复疾病名称，如“IBD”或“肠易激综合征”，查看与疾病相关的菌群；
或回复菌种名称，如“双歧杆菌”或“Hp”，查看与细菌相关的疾病。
👇👇👇点击阅读原文，了解更多人体微生态研究