科研 | Front. Pharmacol.：寻常型银屑病血瘀证患者血清特征代谢产物的代谢组学研究（国人佳作）

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编译：微科盟张娜，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

牛皮癣是一种难治的慢性、全身性炎症性皮肤病，而中医（TCM）在银屑病的辨证论治中显示出独特的优势。我们应用液相色谱-质谱联用的非靶向高通量代谢组学方法，研究不同中医证型的寻常型银屑病（PV）患者血清代谢特征，从内源性代谢产物的角度寻找其发病机制的潜在血清生物标志物。本研究共测定了45例健康对照者和124例PV患者（血瘀组50例，血热组30例，血燥组44例）的血清代谢谱；使用多元统计分析处理原始数据，筛选和鉴定了14种与银屑病中医证候分型相关的生物标志物，其中，血瘀组表现出脂质代谢异常，其特征为低磷脂酰胆碱(PC)、高溶血磷脂酰胆碱(LPC)。我们认为血小板活化因子可作为潜在的生物标志物用于PV血瘀证的临床诊断和鉴别诊断。不同证型寻常型银屑病患者与健康对照组血清代谢产物的差异，为银屑病中医证型提供了客观的物质基础。

论文ID

原名：Metabonomics Study on Serum Characteristic Metabolites of Psoriasis Vulgaris Patients With Blood-Stasis Syndrome译名：寻常型银屑病血瘀证患者血清特征代谢产物的代谢组学研究
期刊：Frontier in Pharmacology
IF：4.225发表时间：2020.11通讯作者：黎莉，韩凌，卢传坚
通讯作者单位：广州中医药大学第二临床医学院

实验设计

实验结果

1.使用UPLC/Q-TOF-MS研究不同中医证型的PV患者和健康对照者的代谢谱

不同中医证型PV患者和健康对照者的信息如表1所示，我们应用UPLC/TOF-MS研究不同中医证型PV患者和健康对照者的血清代谢谱。正离子模式下的总离子色谱图（TIC）如图1所示，其中，血瘀、血热、血燥的PV患者的代谢谱与健康对照组之间存在差异，这表明血清中存在多种与PV中医证型有关的代谢产物。

表1 具有不同中医证候的寻常型PV患者的临床特征和健康对照

图1 正离子模式下的总离子色谱图（TIC）

血瘀、血热、血燥的寻常型PV患者组与健康对照组的代谢谱差异。

2.方法学调查

样本池由各组各10μL血清混合而成。根据样品制备方法，我们制备了质量控制（QC）样品以进行精密度和稳定性研究，其中，每个样品进样6次，我们从TIC中选择10个峰，以评估保留时间和离子响应稳定。六次进样的峰强度和峰个数的相对标准偏差（RSD）均小于10％，表明该仪器的精密度良好，符合分析要求。

我们又制备了质控样品进行稳定性试验。每10-15个样品设置1个质控样品进样，所有代谢组学样品均连续注射，6次注射的峰强度和峰个数的RSD均小于15%，表明该仪器和方法稳定可靠。

3.不同中医证型PV患者的多元统计分析结果

我们使用MarkerView软件对各组的原始数据进行峰识别和匹配，对噪声过滤、数据归一化和3982个保留时间的质荷比（RT m/z）变量进行筛选，我们去除了同位素峰以避免重复计算，并将2454个变量加载到Simca-P软件中进行多元统计分析。我们采用PCA、PLS-DA和OPLS-DA对不同证候类型的样本进行了聚类分析，发现计量图中的代谢状态相似的样品聚集在一起，而不同的样本分布在不同的区域。因此，得分图可以根据代谢差异对实验组样品进行分类。如图2A所示，血瘀组、血热组、血燥组和健康对照组分别聚类，表明这些组之间代谢存在显着差异，而Loading图可以显示有助于分类的成分，离原点越远，有助于分类的成分数量越多，这些成分可以被认为是干扰正常生理代谢的潜在生物标志物。在图2C中，我们将远离Loading图中原点的点筛选为潜在的生物标记，而100次迭代的置换检验结果表明，该模型具有较好的预测能力（图2B）。

图2 多元数据分析和置换检验

（A） OPLS-DA得分图，（B） OPLS-DA的置换检验，（C）PLS-DA的Loading图。

4.潜在的生物标志物筛选和鉴定

根据PLS-DA模式识别结果，我们对VIP值进行排序，结合t检验，筛选了四组之间有显着性差异的代谢物（P <0.05），并从负荷图（图2C）中鉴定了候选化合物，而TOF-MS提供了所筛选代谢物的精确分子量。我们在人类代谢组学数据库（HMDB）中搜索这些化合物，结合同位素分子量、质谱电离片段化模式和生物学意义，确定了潜在的生物标记物。

如表2所示，具有不同中医证候的PV患者和健康对照组中的14种重要代谢物被认为是潜在的生物标志物，这些化合物主要与凝血、精神功能、炎症、抗菌作用和排毒有关，其中，脂质化合物在PV的发展中起重要作用。在本研究中，所有PV组均表现出脂质代谢异常，与健康对照组相比，其特征在于溶血磷脂酰胆碱（LPC）含量高、磷脂酰胆碱（PC）含量低（图3）。

表2  鉴定潜在的生物标志物

*与健康对照组相比，PV组有显著差异。

根据PLS-DA模型中预测的可变重要性（VIP）值，筛选出14种显著差异的代谢物作为潜在的生物标志物。 

图3 有明显变化的典型代谢产物

四组血清中潜在生物标志物的峰面积。

5.ROC曲线

代谢组学研究的目标之一是发现生物标记物，鉴别出一种或一组能够对疾病进行分类的代谢物，并且有高灵敏度(真阳性率)和高特异性(真阴性率)。研究者们通常认为，ROC曲线分析是评估生物标志物性能的金标准。我们从Loading图(图2C)中筛选了一种化合物，经鉴定为血小板活化因子(PAF)，然后用经典的ROC曲线分析评价PAF。图4显示了血瘀组PAF的ROC曲线结果，与健康对照组比较，曲线下面积为0.995(图4A-1)，两组的箱线图如图4A-2所示；与血燥组相比，AUC为0.962(图4B-1)，两组的箱线图如图4B-2所示；与血热组相比，AUC为0.9(图4C-1)，两组的箱线图如图4C-2所示，AUC值均大于0.9，表明PAF对血瘀组和其他组有良好的预测能力，其中，PAF可能是PV血瘀证重要的生物标志物。

图4 ROC曲线图和PAF的箱线图

（A）血瘀组VS健康对照; （B）血瘀组VS血燥组；（C）血瘀VS血热组。

讨论

表2中有14个潜在的生物标志物，主要涉及甘油磷脂代谢途径，也与亚油酸代谢、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢以及戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化有关。近年来，已有研究报道牛皮癣患者脂质代谢异常。PV患者易患糖尿病、高脂血症、高血压和其他代谢性疾病，暗示PV与代谢综合征密切相关，涉及到磷脂、脂肪酸、氨基酸、花生四烯酸代谢和其他代谢周期。在本研究中，所有PV患者均表现出脂质代谢异常，与健康对照组相比，其特点是LPC水平升高，PC水平降低。PV患者血清中LysoPC(16：0)、LysoPC(18：2)、LysoPC(18：1)、LysoPC(20：1)水平显著高于健康对照组，而PC(18：3/18：1)、PC(22：5/16：1)、PC(20：4/18：0)水平显著低于健康对照组。这一结果与之前PV的脂质组学研究一致。低密度脂蛋白(LPC)是氧化型低密度脂蛋白(LDL)的主要活性成分，具有广泛的生物学效应，比如参与动脉粥样硬化的发生和发展。LPC是PC的降解产物，它可以引起炎症反应，增加氧化应激，干扰血管内皮功能，破坏斑块稳定性；LPC在动脉粥样硬化的预防、诊断和治疗中起着至关重要的作用；棕色脂肪组织(BAT)由于其燃烧脂肪的能力，最近成为治疗肥胖症和相关疾病的潜在治疗靶点；溶血磷脂酰胆碱-酰基(LysoPC-酰基)C16：1、溶血磷脂酰胆碱-酰基C16：0和磷脂酰胆碱-双酰基C32：1的浓度与BAT体积以及BAT活性呈正相关。PAF，也称为PC（O-16：0/2：0），是一种广泛存在的强效磷脂激活剂和炎症介质，在炎症性疾病和心血管疾病的发病机理中具有重要作用。PAF可引起血小板凝集和过敏反应,它在许多不同类型的细胞（尤其是参与宿主防御的细胞，例如巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、血小板和内皮细胞）中低表达。血小板活化因子受体是一种G蛋白偶联受体，存在于多种细胞的细胞膜上，一旦与受体结合，PAF就会动员钙并激活多种信号通路。在本研究中，血瘀证患者的PAF水平明显高于非血瘀证患者，非血瘀证患者的PAF水平明显高于健康对照组，ROC曲线显示出极好的预测能力（图4A）。近年来，人们越来越认识到，血小板活化可能是PV的主要致病因素，而血小板活化指标通常可以暗示血小板功能异常与否。血小板也是引发和调节免疫和炎症过程的免疫细胞，除了作为止血和血栓形成的主要介质，血小板功能障碍也与PV的发病机理密切相关。PAF尚不能作为PV的特征性诊断标志物，但有望被用作诊断和鉴别PV中血瘀证的潜在生物标志物，血小板活化因子的增加可能是血瘀证的发病机制之一。总的来说，本研究开发了一种非靶向代谢组学方法来研究不同中医证候的PV患者与健康对照之间的差异。我们筛选和鉴定了14个潜在的生物标志物，其中，PV患者血清磷脂酰胆碱(PC)水平较低，溶血磷脂酰胆碱(LPC)水平较高。本研究表明PAF可作为血瘀证诊断和鉴别的生物标志物，其水平验证了PV的中医证候鉴别有客观的物质基础。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33312124/

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