长文解析|2篇Cell，1篇Nature探讨更好使用CRISPR工具

iNature：CRISPR-Cas9蛋白在细菌的功能是靶向及破坏外源DNA或者是RNA的入侵，并且CRISPR-Cas9在动物，植物，真菌，细菌等有了广泛的应用。Corn研究组及Marson研究组合作使用CRISPRa的方法可以鉴定到功能性的增强子，而且也揭示了非编码序列是怎么跟人类的免疫性疾病相关；徐剑课题组及周峰课题组首次利用“biotinylated dCAS9”的方法建立了高分辨率，位点特异原位DNA-蛋白质以及其他元件的互作网络，这种3D互作组学手段有助于科研人员今后就调控元件与疾病和发育的关系作进一步深入研究；Dounda课题组也在Cell发文解析了CRISPR-Cas9抑制物的作用机制，阐述了AcrIIC1（广谱型）及 AcrIIC3（特异型）抑制 Cas9的机理，AcrIIC1结合Cas9 HNH结构域，进而使Cas9不能形式切割DNA，而AcrIIC3抑制NmeCas9 同DNA结合，诱导其二聚化。

增强子是可以增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。但是，实际上，对于怎么更好的研究增强子的功能还是有一定的困难，尤其是怎么定位增强子的特异序列。系统性的定位到功能性的增强子以及他们的生物学功能对于疾病的发生发展具有重要的意义，同时对于非编码的DNA序列有更深层次的理解。虽然功能性的增强子可以通过基因组序列干扰的方式获知，但是这种你方法对于大部分增强子都具有很大的局限性，尤其是在特殊的细胞环境里去研究增强子具体的功能。

在8月30日，Corn研究组及Marson研究组合作在国际顶级期刊Nature上发文，他们假设转录激活子被募集到增强子上那是对于基因的表达是足够的，即使是在测试的细胞的增强子暂时还不是处于活性状态。Corn研究组及Marson研究组描述了一种刺激-应答性的增强子的平台技术，但是这又是独立于刺激作用。

Corn研究组及Marson研究组使用修饰过的CRISPR激活系统(CRISPRa)在一个超过100Kb的基因组区域里，方便的募集转录激活子在这一区域，而这已区域是在自身免疫的风险基因座CD69 及 IL2RA。他们发现几个 CRISPRa-应答性的元件，也就是拥有刺激-应答性增强子的染色质的生物学特征（图.1）。

图.1发现增强子的操作技术流程

使用小鼠模型，这俩个研究组发现干扰疾病相关的 Il2ra增强子序列，并不能阻碍 Il2ra的表达，但是当外援信号刺激时，可以延迟基因激活的应答时间（图.2）。

图.2 Il2ra增强子功能验证

增强子缺失表明，naive T cells朝着T H17细胞转化，而不是向调控型的T细胞状态转化（图.3）。

图.3 naive T cells的分化过程

总的来说，使用CRISPRa的方法可以鉴定到功能性的增强子，而且也揭示了非编码序列是怎么跟人类的免疫性疾病相关。

德克萨斯州西南医学中心的徐剑助理教授课题组与复旦大学附属中山医院及生物医学研究院（IBS）周峰研究员课题组合作，首次利用了“biotinylated dCAS9”的方法建立了高分辨率，位点特异原位DNA-蛋白质以及其他元件的互作网络 。8月24日，相关研究成果以《通过dcas9原位捕捉染色质相互作用网络》（“In Situ capture of chromatin interactions by biotinylated  dCAS9”）为题在国际顶级学术期刊《细胞》（Cell）杂志上发表，徐剑教授和周峰研究员为共同通讯作者。徐剑教授为该文章的Lead Contact。

随着功能基因组学的飞速发展，对调控基因表达的顺式（cis-）和反式(trans-)作用元件进行系统研究成为当前急需填补的领域空白。此前也有利用3D基因组图谱的方法来研究染色质结构的组学技术：染色质免疫沉淀技术CHIA-PET能够鉴定到全基因组范围内的染色质互作水平，最近几年发展起来的Hi-C技术可以在更大范围内捕获包含各种拓补结构在内的与染色体相关的互作关联信息。但遗憾的是，目前为止，这些技术都无法得到与基因位点特异性相关的互作图谱，同时也缺乏反式作用原件(trans-)参与介导的互作图谱信息（Figure.2）。

图2.徐剑及周峰课题组调控元件捕获操作流程

据介绍，此次研究建立的“CAPTURE方法”可以针对感兴趣的基因位点进行全面的挖掘，在原位发现对DNA的转录起到重要调控作用的蛋白质及其他元件，这种3D互作组学手段有助于科研人员今后就调控元件与疾病和发育的关系作进一步深入研究。

同日，Dounda课题组也在Cell发文解析了CRISPR-Cas9抑制物的作用机制。阐述了AcrIIC1（广谱型）及 AcrIIC3（特异型）抑制 Cas9的机理，并且这俩个蛋白的作用机制是不一样的。Dounda认为AcrIIC1结合Cas9 HNH结构域，进而使Cas9不能形式切割DNA，而AcrIIC3抑制NmeCas9 同DNA结合，诱导其二聚化（详见 长文详解|Doudna的Cell力作，CRISPR-cas9抑制物作用机理）（Figure.3）。

Fig.3 Daunda课题组提出的model

通讯作者简介

Fig.4 Jacob E. Corn教授

Jacob Corn是创新基因组学研究所的创始人，现在是主任，加州大学伯克利分校的教授。Corn在加州大学伯克利分校度过了他的研究生阶段，当时的研究方向是DNA复制相关的课题；Corn在华盛顿大学做了一轮博士后，其研究课题是使用计算机自动设计蛋白抑制物。之后，Corn去了Genentech公司，并最后成为了Genentech的集团负责人；在业余时间，Jacob享受长时间的背包旅行和攀岩。

Corn实验室的研究重点旨在通过开发和应用下一代基因组编辑技术来实现遗传疾病的最终治疗。Corn通过对疾病机制的基本了解，致力于改善人类健康。 Corn采取多学科的方法来解决这些问题，包括计算建模，体外生物化学和生物物理学，全基因组筛选和机械细胞生物化学。在过去十五年间，他已经跨越了学术和行业，从事包括传染病，神经生物学和肿瘤学在内的治疗领域。

Corn在Nature，NBT，Stucture，Science 等顶尖杂志发表了36篇文章，其领导的实验室在基因基因编辑等方面有比较深的造诣。

Fig.5 Alex Marson助理教授

Marson在麻省理工学院Whitehead研究所获得博士学位，是在Rick Young和Rudolf Jaenisch的联合指导进行的。在医学院完成学业后，Marson在布里格姆妇女医院实习和工作，后来Marson加入了UCSF；在Marson完成全职传染病的临床工作的最后一年，Marson 为 Sandler 教授的职工。现在，Marson是UCSF微生物/免疫学系的助理教授。Marson实验室正在继续研究T细胞的遗传和表观遗传学调控通路，以了解CD4 + T细胞亚群如何发展免疫宿主所需的高度专业化功能。

使用基因组技术，Marson课题组研究了多种细胞类型，Marson研究集中在两个重要的重要细胞类型：调节性T细胞，这是预防自身免疫性疾病所必需的;和胚胎干细胞，其分化成每种类型的成体细胞的潜力，为再生医学提供了巨大的希望。

Marson在Nature，Cell，PNAS等顶尖杂志发表了数十篇文章，其领导的实验室在T细胞免疫调节方面等方面有比较深的造诣。

Fig.6 徐剑助理教授

徐剑,现在是德克萨斯州西南医学中心的助理教授。徐剑，1996-2000年，在复旦大学获得本科学位；2000 - 2003年，在复旦大学医学院获得硕士学位；2003 - 2008年，在UCLA大学由HHMI研究员Stephen T. Smale的指导下，获得博士学位 ；2008 - 2011年，在哈佛医学院中的波士顿儿童医院的HHMI研究员 Stuart H. Orkin的实验室作为工作人员； 2012 - 2014年，在儿科血液肿瘤学成为工作人员；2014 - 至今，德克萨斯州西南医学中心的助理教授。

徐剑的实验室研究调节造血和白血病基因表达的分子机制，特别是控制非编码调节元件（例如转录增强子）的机制和表观遗传调节蛋白（例如Polycomb蛋白）。 同时徐剑也负责德克萨斯州西南医学中心儿童研究所核心测序平台，使用下一代测序技术研究癌症遗传学和基因组学。 徐剑实验室的长期目标是阐明转录和表观遗传机制控制正常和恶性血细胞发育。

徐剑在Nature，Cell，Science，PNAS，cell stem cell 等顶尖杂志发表了将近60篇文章，其领导的实验室在基因转录调控等方面的研究有比较深的造诣，是一刻冉冉升起的学术新星。

Fig.7 周峰教授

周峰，复旦大学生物医学研究院的研究员。1996-2000年，在复旦大学化学系学习，并获得学士学位；2002-2007年，在清华大学生物科学与技术系获得博士学位，2007-2015年，在美国哈佛医学院做博士后；2015-至今，在复旦大学生物医学研究院任研究员。

周峰实验室的研究方向是转录后的基因的调控。全蛋白检测平台能够对由基因检测所能发现的靶点进行进一步分析，能够验证那些基因层面发生的变化是否也在蛋白质的层面得到验证。更近一步，全蛋白检测也能够发现那些在转录后期间的调控，对二代测序方法进行了很好的补充。为进一步利用功能学实验验证我们所发现的疾病的分子发病机制提供了不可或缺的信息。

       周峰主持和参与多项国家和省部级项目，国家自然科学基金重点项目、面上项目，上海市科委项目等。迄今为止，已在国内外学术刊物上发表论文20余篇，包括Nature Genetics, Nature Cell Biology, Nature Communications, Cancer Cell Analytical Chemistry等。

Fig.8 Jennifer A. Doudna教授

Doudna教授于1964年生，在1985年从波莫纳学院获得化学专业的学士学位，在哈佛大学获得生物化学博士学位，研究方向是核糖体酶，其导师是诺贝尔奖获得者Jack W. Szostak；之后在克罗多拉大学跟着诺贝尔奖获得者Thomas Cech从事博士后研究工作；从1997年起，Doudna成为HHMI研究员；2000年，Doudna被推荐为耶鲁大学分子生物物理及生物化学部门的Henry Ford II教授；2002年，Doudna接受了加州伯克利大学的分子与生物化学的教授，这样可以离她家更近，在2012年，Doudna及其同事发现了CRISPR-cas9系统。

在2001年，Doudna获得 在生物化学方面获得Eli Lilly Award ；2013年获得美国分子与生物化学学会颁发的Mildred Cohn Award；2014年同张丰及 Emmanuelle Charpentier共同获得Jacob Heskel Gabbay Award，另外还获得了NIH资助的Lurie 奖，同Emmanuelle Charpentier共同获得Dr. Paul Janssen奖及生命科学突破奖；在2015年，同Emmanuelle Charpentier共同获得 Princess of Asturias 奖及Gruber Prize；2016年，获得了唐等奖项，并且被选为英国皇家外籍院士；2017又收获了 Japan奖，F. Albert Cotton 奖章， Albany Medical Center奖。

Doudna实验室最主要的研究方向是CRISPR-cas 9的产生作用的机理以及在科研中的应用，这主要又包括三个方面：

1.细菌的免疫作用；

2.RNA干扰；

3.翻译控制。

在CRISPR-cas 9方面，同Emmanuelle Charpentier及张丰并称为CRISPR三剑客，在这个领域中做出了卓越的贡献。Doudna在Nature，Cell，Science 等顶尖杂志发表了180篇文章，其领导的实验室在CRISPR-cas 9的机理及应用等方面的研究硕果累累，在国际上享有盛誉。

备注：

周峰,及徐剑的Cell文章介绍主要来源于复旦大学官网介绍

http://news.fudan.edu.cn/2017/0825/44231.html

徐剑的个人介绍来源于德克萨斯州西南医学中心

http://profiles.utsouthwestern.edu/profile/153851/jian-xu.html

周峰的个人介绍来源于复旦大学生物医学研究院周峰课题组

http://ibs.fudan.edu.cn/peoplemore.php?id=275

Jacob Corn个人介绍来源于Corn lab

https://cornlab.com/research/