杨辉，刘如谦，章美玲及许争锋等团队发表5篇Nature等文章，发现线粒体碱基编辑器的治疗疾病潜力及脱靶情况

iNature

全蛋白胞嘧啶碱基编辑器 DdCBE 使用 TALE 蛋白和双链 DNA 特异性胞苷脱氨酶 (DddA) 介导靶向 C•G 到 T•A 编辑。

2022年4月4日，博德研究所刘如谦团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA”的研究论文，该研究为了提高编辑效率并克服 DddA 严格的 TC 序列约束，使用噬菌体辅助的非连续和持续进化来进化具有改进活性和扩大靶向范围的 DddA 变体。

与经典的 DdCBE 相比，具有进化 DddA6 的碱基编辑器将 TC 的线粒体 DNA (mtDNA) 编辑效率平均提高了 3.3 倍。含有进化的 DddA11 的 DdCBE 为线粒体和核碱基编辑提供了更广泛的 HC（H = A、C 或 T）序列兼容性，将 AC 和 CC 靶标的平均编辑效率从标准 DdCBE 的不到 10% 提高到 15-30% 。该研究使用这些进化的 DdCBE 在非 TC 靶位点有效地在人类细胞中安装与疾病相关的 mtDNA 突变。DddA6 和 DddA11 大大提高了全蛋白碱基编辑的有效性和适用性。

另外，2022年3月18日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉、上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙、上海交通大学章美玲共同通讯在 Cell Discovery （IF=11）在线发表题为“Mitochondrial base editor DdCBE cause substantial DNA off-target editing in nuclear genome of embryos” 的研究论文，该研究使用 GOTI方法（点击阅读），以评估 DdCBE 对 mtDNA 和核 DNA 修饰的脱靶效应。该研究首次展示了 DdCBE 在整个核基因组中导致数千个脱靶 SNV，这些 SNV 富含 C-to-T/G-to-A 转换，这是低保真碱基编辑器 BE3 产生的 SNV 数的两倍。总之，该研究发现DdCBE 对核基因组具有广泛的脱靶效应，强烈需要优化 DdCBE 以在 mtDNA 上进行特定的碱基编辑，特别是在用于治疗线粒体疾病之前（点击阅读）。
2022年2月1日，上海交通大学章美玲，李文及中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉共同通讯在 Cell Discovery  在线发表题为“Human cleaving embryos enable efficient mitochondrial base-editing with DdCBE” 的研究论文，该研究表明，DdCBE 是一种有效的碱基编辑器，可在人类胚胎 mtDNA 中诱导点突变，并且在 8 细胞胚胎中的效率要高得多。 鉴于旁观者和脱靶编辑特征，DdCBE 仍有待进一步优化用于未来的基础和治疗研究。2022年2月1日，南京医科大学许争锋、沈斌及凌秀凤共同通讯在 Cell Discovery 在线发表题为“DdCBE-mediated mitochondrial base editing in human 3PN embryos” 的研究论文，该研究首次证明了在人类 3PN 胚胎中进行 DdCBE 介导的线粒体碱基编辑的可行性，表明在人类早期胚胎阶段进行致病性 mtDNA 突变校正的可能性。 理论上，DdCBE可以纠正mtDNA中的一系列致病性A ∙ T-to-G ∙ C突变，从而达到治疗效果。尽管在 3PN mtDNA 中检测到的脱靶编辑可能不足以产生表型，但当前的线粒体碱基编辑策略需要进一步优化以满足任何临床应用的需求。2020年7月8日，博德研究所David R. Liu及华盛顿大学医学院Joseph D. Mougous共同通讯在Nature 在线发表题为“A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing”的研究论文，该研究描述了一种细菌间毒素，将其命名为DddA，它可以催化dsDNA中胞苷的脱氨。该研究设计了无毒且无活性的split-DddA半分子：DddA分割的一部分结构域（转录激活子样效应子阵列蛋白）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂的融合，产生了无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE），可催化人mtDNA中的C•G到T•A转化，具有高靶标特异性和产品纯度。该研究使用DdCBEs建模人类细胞中与疾病相关的mtDNA突变，从而导致呼吸速率和氧化磷酸化的改变。不含CRISPR的DdCBE可以精确操纵mtDNA，而不是消除因被靶向核酸酶切割而产生的mtDNA拷贝，这对线粒体疾病的研究和潜在治疗具有广泛的意义（点击阅读）。

每个人类细胞可以包含数百个环状 mtDNA 拷贝，这些环状 mtDNA 编码 RNA 和介导 ATP 产生的蛋白质。由于线粒体在能量稳态中的重要作用，mtDNA 中的单核苷酸突变可导致发育障碍、神经肌肉疾病、癌症进展和越来越多的其他人类疾病。能够在 mtDNA 中精确安装点突变的技术可以揭示这些突变在发病机制中的作用，并为潜在的治疗应用提供纠正它们的方法。

可编程核酸酶可以在含有特定突变的 mtDNA 拷贝中进行靶向双链断裂，从而消除这些拷贝。然而，核酸酶不能引入特定的序列变化。基因组编辑器，包括碱基编辑器和先导编辑器，直接在目标 DNA 序列中安装精确的变化，但通常依赖于引导 RNA 序列来引导 CRISPR-Cas 蛋白与其目标 DNA 结合。由于将引导 RNA 导入线粒体的挑战，迄今为止，基于 CRISPR 的系统尚未可靠地用于 mtDNA 工程。

为了应对这一挑战，最近开发了 DdCBE，以在 mtDNA 内实现有针对性的 C•G 到 T•A 转换。DdCBE 使用两个 TALE 蛋白来指定用于编辑的双链 DNA (dsDNA) 区域。每个 TALE 都与无毒的一半 DddA 和一份尿嘧啶糖基化酶抑制剂 (UGI) 蛋白融合。两个 TALE 融合的分裂-DddA-UGI 融合体与相邻位点的结合促进了功能性 DddA 的重新组装，以使 dsDNA 间隔区域内的靶胞嘧啶脱氨基。DdCBE 已应用于人类胚胎、小鼠、斑马鱼和植物的线粒体碱基编辑。

噬菌体辅助进化 DddA 衍生的胞嘧啶碱基编辑器以提高活性和扩大靶向范围（图源自Nature Biotechnology ）

在该研究中观察到一系列 mtDNA 编辑效率（4.6-49%），这取决于目标 C 在 DNA 结合的 DdCBE 两半之间的间隔区域内的位置。研究人员假设通过提高 DddA 与不同 TALE 设计和脱氨酶方向的兼容性，增强分裂 DddA 的活性可以提高假定的 5'-TC 环境下的 mtDNA 编辑效率。

鉴于 DddA 的严格序列偏好，最初的 DdCBE 主要限于 TC 靶标。在这项研究中，试图通过应用快速噬菌体辅助连续进化 (PACE) 和相关的噬菌体辅助非连续进化 (PANCE) 方法来增加 TC 和非 TC 靶标的 DdCBE 活性。DdCBE 活性选择的开发，导致了几种 DddA 变体，这些变体在进化过程中具有丰富的保守突变。

与野生型 DddA 相比，进化变体 DddA6 和 DddA11 介导了 TC 靶标的 mtDNA 碱基编辑效率平均提高了约 4.3 倍。值得注意的是，DddA11 将 mtDNA 和细胞核中 AC 和 CC 靶标的平均批量编辑水平从标准 DdCBE 的不到 10% 提高到 ~15-30%。这些变体共同能够在 TC 和非 TC 目标上安装或校正 C•G 到 T•A 点突变，从而大大扩展了 DdCBE 的整体效用。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41587-022-01256-8

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