在你的肿瘤课题中加点肿瘤干细胞研究

1. 引言

乳腺癌的转移由细胞骨架所驱动，从而使得细胞能够有效地迁移和侵袭。Anilin是一种独特的支架蛋白，调节主要的细胞骨架结构，如肌动蛋白丝、微管等等。针对Anilin如何调控乳腺癌细胞侵袭和转移的分子机制问题，Wang dongdong团队于2020年3月22号在Breast Cancer Research发表了：支架蛋白Anillin通过控制细胞干性和分化的非典型机制调节乳腺癌细胞的迁移、生长和转移过程。今天让小编来给大家揭示这篇文章所谓的非典型机制研究思路：

2. 方法与结果

 1）细胞表型—Anillin可以调控乳腺癌细胞的体外迁移、侵袭和在琼脂中的生长

首先，作者研究Anillin在乳腺癌侵袭和转移中的作用，发现它在强侵袭性乳腺癌细胞系中表达显著增加，且在侵袭较强的子代细胞系中表达量高于亲代细胞。所以Anillin的高表达与乳腺癌细胞的转移潜能呈正相关。接下来，作者使用CRISPR/Cas9技术敲除高侵袭性乳腺癌细胞中的Anillin，WB验证敲除效率，敲除细胞系迁移和侵袭也受到抑制。在不同细胞系中也得到相似的结果。

随后，作者将Anillin在低侵袭细胞系中过表达，WB检测蛋白表达量增加约8倍。这种Anillin的过表达显著促进了细胞的侵袭能力。

最后，为了想探究Anillin对于肿瘤细胞增殖的影响，通过利用软琼脂集落培养实验表明，肿瘤细胞在敲除Anillin后显著减少了在琼脂培养的集落形成，影响了细胞的增殖，而Anillin过表达后显著促进了细胞在琼脂上的生长和增殖。作者还构建了带有GFP标签的Anillin—N端片段，过表达这种截短体也可以促进细胞的侵袭和软琼脂集落生成，表明该分子的N端部分对于Anillin在体外对乳腺癌细胞的促肿瘤增长是必不可少的。

结论：在体外敲除Anillin将明显减弱肿瘤细胞的迁移侵袭，也会进一步影响肿瘤细胞在软琼脂上形成集落的效率，影响肿瘤的增殖。

2）动物实验—Anillin表达缺失对乳腺癌体内生长和转移的抑制作用

作者检测了Anillin对乳腺癌在体内生长和转移的影响。首先构建荧光报告细胞系并用流式筛选。将分离细胞注射到NSG小鼠乳腺内，Anillin敲除后明显抑制肿瘤生长。肿瘤免疫组织学分析显示，Anillin敲除后肿瘤细胞的增殖没有改变而细胞凋亡加速，并且减弱了肿瘤细胞系从乳腺向肺、肝、肾和淋巴结的转移扩散。

之后作者将乳腺癌细胞注射到小鼠的左心室建立肿瘤转移模型，Anillin敲低的细胞系抑制了其在体内的扩散，并显著减少了肿瘤向肝脏的转移，同时，向肺、肾、卵巢和骨骼的转移受到显著抑制。在肿瘤细胞中过表达N-端截短体后显著促进了原发肿瘤的生长，同时增加肺部转移的趋势。

结论：Anillin是体内乳腺癌生长和转移的重要驱动力。

3）机制探究—Anillin敲除改变乳腺癌细胞的胞外基质粘附和细胞骨架结构

接下来，作者研究Anillin影响乳腺癌细胞迁移和侵袭的机制。在肿瘤细胞中敲除Anillin显著增加了它们与I型胶原的粘附，而在过表细胞系中则抑制了胶原粘附。细胞与胞外基质的粘附受细胞质膜和基质界面形成的焦点黏附(FA)复合体的调节，可通过FA标记物-磷酸化(P)paxillin进行免疫标记。对照细胞在细胞的边缘FA处显示出明显的P-paxillin标记，相反，失去Anillin则FA分布在细胞的整个基底表面。

免疫荧光显示，在Anillin敲除的细胞中，细胞骨架结构发生了变化，表现为突出的基底应力纤维的组装。因为肌动马达蛋白NMII在调节应力纤维组装和细胞迁移中有关键作用，作者使用了抑制剂Blebbistatin抑制NM II的活性，结果抑制了应力纤维的组装，并逆转Anillin敲除细胞的迁移减弱的情况。免疫荧光显示Anillin主要位于未分裂肿瘤细胞的核中，不与胞质肌动蛋白共定位，与以前发表的研究一致，Anillin在不同的肿瘤细胞核中积累。

结论：Anillin不直接影响乳腺癌细胞中的细胞骨架结构，可能通过作为细胞内稳态的核调节器间接控制外周细胞骨架、胞外基质粘附、细胞运动和生长。

4）肿瘤干细胞探究—Anillin调节乳腺癌细胞的干性和分化

作者使用两种方法来研究Anillin调节乳腺癌干细胞(BCSC)。一种方法是经典的乳房形成实验来确定BCSC的自我更新能力，Anillin敲除显著抑制了乳房的生长，Anillin表达的增加促进了乳房组织的形成。

而另一种方法是流式细胞术实验来量化干细胞特异性表面标记的表达，Anillin耗竭显著增加CD24高表达细胞，表明开始向细胞分化转变。这些数据表明高水平的Anillin刺激BCSC，而失去Anillin则抑制乳腺癌细胞的干性。

作者将对照和Anillin敲除的细胞株进行了RNAseq，分析出上下调基因，GO分析显示，敲除Anillin导致与上皮和表皮分化相关的分子通路上调，以及与RNA聚合酶II依赖的基因转录相关的一些基因下调。RT-PCR和免疫印迹也证实以上的结果。

这表明Anillin的敲除导致乳腺癌细胞的基底型转分化。同时作者发现在衰老的肿瘤细胞中E-cadherin和P-cadherin的表达都有显著的上调，且没有间质标志物的表达改变，体内结果也同样。Anillin缺失的肿瘤细胞中调节细胞干性的几个转录因子的表达显著下调，如TBX18、Tfcp2l1、FOXK1、和SOX-9，说明可能Anillin对乳腺癌细胞干性和分化有着重要的影响。

结论：Anillin的敲除减少了肿瘤干细胞的自我更新并促进干细胞分化

5）分子机制探究—E-钙粘素在乳腺癌细胞（Anillin敲除）的迁移和侵袭中的作用

最后，作者探究了乳腺癌细胞（Anillin敲除）的转分化是否在抑制细胞迁移和侵袭方面起到作用。E-和P-钙粘素都是已知的细胞迁移调节因子，E-cadherin和P-cadherin在对照组和Anillin敲除的细胞中表达一过性下调，并通过划痕实验和Matrigel侵袭实验显示E-cadherin耗尽降低了对照细胞的迁移，并增加了敲除细胞的迁移。E-cadherin逆转了敲除细胞的减弱侵袭，而不改变对照细胞的侵袭能力，从而挽救了Anillin耗竭对肿瘤细胞迁移的抑制作用。相反，下调P-cadherin的表达降低了对照细胞的迁移和侵袭力，但不影响敲除细胞的迁移和侵袭。

结论：E-cadherin表达上调可以挽救在Anillin敲除引起的乳腺癌细胞迁移和侵袭减弱中的作用。

3. 研究思路

今天的文章解读就到这，下次继续。。。。。 

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