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那些年,老师姐构建载体踩过的坑

林诺 科研讲坛 2021-02-21
课题组的小师弟在克隆到新基因之后,终于开始进入到构建载体的环节了,就此打开新世(da)界(keng)的大门!然而我可爱的师弟在我对他说“得空去老师那儿领两支DH5α”之后,昂起他可爱的小脑袋一脸无辜地问我:


师姐,你说领啥?
……看来还是要从头教才行,真是亲师弟啊,专业课的时候都干什么去了?
师弟:谢谢师姐~

1. 质粒的前世今生
并不是所有的基因都存在于染色体上。1952年,Joshua Lederberg创造出“Plasmid”(质粒)一词,它指的是染色体以外的遗传决定物质,共价、闭合、环状双链DNA(cccDNA),大小在1kb~1000kb范围内。质粒上一般都携带有基因或其他遗传信息。
20世纪70年代,限制内切酶、DNA连接酶和凝胶电泳实验的出现推动了分子克隆的发展,科学家们将染色体上面的DNA片段剪下来,然后插入到质粒中去,实现了质粒的人工定向改造。
天然存在的野生型质粒分子量大(>15kb)、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷,不能满足克隆载体的要求。科学家们在删掉绝大部分多余的和功能研究无关的片段后,给质粒安装了各种酶切位点以及遗传标记(如抗性基因氨苄霉素等)。改造后的质粒可以更好地满足各种实验需求,如克隆或下调基因等。

2. 读懂质粒


此图为例,质粒名称为pEGFP-N3,p代表plasmid (质粒),EGFP指的是enhanced green fluorescentprotein (增强型绿色荧光蛋白)。
复制起始位点 (Ori):招募复制蛋白,进行质粒的自我复制,增加拷贝数,随着细胞的增殖而增殖;
抗性基因:在选择培养基中加入抗生素,抗性基因赋予宿主菌分解抗生素的能力,携带有相关质粒的细胞可以在培养皿上生长下来,方便筛选。
Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性;
tetr 可以阻止四环素进入细胞;
camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性;
neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活。
多克隆位点(MCS):它具有多个限制内切酶的单一切点(质粒上只能有该内切酶的唯一酶切序列),便于目的基因的插入。最常见的是β-半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统。
表达系统元件:启动子(promoter)-核糖体结合位点(RBS)-转录终止信号(AATAAA同时是poly A)。
报告基因:如β-半乳糖苷酶、EGFP、luciferase等,便于迅速检查功能基因是否表达。
引物结合区(primer):一般位于多克隆位点区的上、下游,便于通用引物的PCR验证、测序验证。

3. 质粒图谱查询方法
方法一:Vector NTI 软件
这款软件的软件包里包括常见和经典的质粒图谱。要想对质粒图谱了解更直观,安装这款软件是非常必要的。

激活数据库后打开的某个分子后的界面截图

该程序自带的数据库(Vector NTI database)包括:DNA/RNA、蛋白质、内切酶、寡核苷酸和凝胶marker。另外这个程序是提供数据库开发(Database Explorer)功能的,我们也可以自己手动增加、删减和修改自己的数据库,操作都比较方便。
如果我们要创建新的分子,有四种方法:用GenBank/GenPept、EMBL/SWISS-PROT and FASTAASCII等格式输入DNA或氨基酸、手动粘贴保存到数据库、从其他分子、接头或载体中拼接构建和从DNA或RNA分子的编码区翻译蛋白质。需要注意的是,用GenBank/GenPept、EMBL/SWISS-PROT and FASTAASCII等格式输入的分子都能显示出序列和结构图,但自己手动粘贴的没有,需要再编辑。
方法二:质粒图谱的网站
http://www.addgene.org/
http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ebi.ac.uk/
方法三:经过改造过的质粒
上述方法不能查询到改造过后的质粒图谱。我们可以在文献中搜索该质粒的名称,进而了解到质粒具体信息。

4. 构建载体避坑
说起连载体那真的是真的是一把心酸泪啊!当年载体连不上的那些场景,至今还历历在目,索性把踩过的雷全部翻出来讲给师弟,也好让他以后构起载体来省事一点(可能实际上并没什么卵用)。
1)设计引物,在5’端加保护碱基
哇,当年没加之前做了好久都做不出来啊,我的天。保护碱基的目的是为了PCR产物酶切的过程中,避免内切酶的空间位阻。或者另一种方法是,把片段连接在T载体上,不加保护碱基也行。
2)观察载体上的酶切位点
构载体之前好好检查一下,质粒图谱上是否存在设计的酶切位点,存在几个。如果没有,要尽早更换酶切位点。然而我当年构载体的时候,发现自己的片段里面也有酶切位点,还有好几个,更有甚者,高效的内切酶还都给我切开了,苍天呐!


3)PCR污染
跑水平胶的时候,有时候会出现无模板的空白对照也出现相应大小的条带的情况。当时我怀疑过和更换过的条件有:基因组污染、引物污染、PCR mix污染、EP管污染、PCR仪故障,以及是不是自己智障。
后经实验室一位善良的师兄提点:跑水平胶之前最好新配缓冲液,别懒省事,它每天被那么多人用,里面难免被其他人的片段污染了。
我:不愧是师兄,说的好有道理啊!


4)回收片段浓度
回收片段的浓度最好在30或者50 ng/ul以上比较好,浓度过低或者过高都不太容易连接到载体上。我最开始回收水平胶的时候,回收出来的浓度只有几个单位,被小老师讽刺:
你去弄点自来水测一测都比你吭哧吭哧回收出来的高好吧?
反省了好久,感觉自己回收步骤也没问题啊,最后还是同一位善良的师兄告诉我:
你别用那个试剂盒了,那里面的柱子被我前几天和另一个盒子的搞混了,分不出来了。
我当时:??????


5)转化热激
按说这个不用专门提醒。以大肠杆菌为例,酶切后涂板前是有一个“42 ℃热激90 s”的步骤的,然而我在第一次抄同学的重组转化实验步骤的时候,这一条抄漏了,最开始做的转化都没有热激……
没有热激……
有热激……
热激……
激……
这载体还能构上真就见了鬼了。热激的作用是促进细胞吸收DNA复合物,帮助质粒进入细胞。
构载体这种事情,提醒的再多,还是要亲自上手做,大家但凡构过载体的,谁不是心字头上数把刀?科研之路,前路漫漫啊。
我最后送了师弟一张自己当年的小伙伴送给的手机屏保,祝他一切顺利吧。


 注:此推文未经许可禁止转载!

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