此图为例,质粒名称为pEGFP-N3,p代表plasmid (质粒),EGFP指的是enhanced green fluorescentprotein (增强型绿色荧光蛋白)。复制起始位点 (Ori):招募复制蛋白,进行质粒的自我复制,增加拷贝数,随着细胞的增殖而增殖;抗性基因:在选择培养基中加入抗生素,抗性基因赋予宿主菌分解抗生素的能力,携带有相关质粒的细胞可以在培养皿上生长下来,方便筛选。Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性;tetr 可以阻止四环素进入细胞;camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性;neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活。多克隆位点(MCS):它具有多个限制内切酶的单一切点(质粒上只能有该内切酶的唯一酶切序列),便于目的基因的插入。最常见的是β-半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统。表达系统元件:启动子(promoter)-核糖体结合位点(RBS)-转录终止信号(AATAAA同时是poly A)。报告基因:如β-半乳糖苷酶、EGFP、luciferase等,便于迅速检查功能基因是否表达。引物结合区(primer):一般位于多克隆位点区的上、下游,便于通用引物的PCR验证、测序验证。 3. 质粒图谱查询方法方法一:Vector NTI 软件这款软件的软件包里包括常见和经典的质粒图谱。要想对质粒图谱了解更直观,安装这款软件是非常必要的。
激活数据库后打开的某个分子后的界面截图 该程序自带的数据库(Vector NTI database)包括:DNA/RNA、蛋白质、内切酶、寡核苷酸和凝胶marker。另外这个程序是提供数据库开发(Database Explorer)功能的,我们也可以自己手动增加、删减和修改自己的数据库,操作都比较方便。如果我们要创建新的分子,有四种方法:用GenBank/GenPept、EMBL/SWISS-PROT and FASTAASCII等格式输入DNA或氨基酸、手动粘贴保存到数据库、从其他分子、接头或载体中拼接构建和从DNA或RNA分子的编码区翻译蛋白质。需要注意的是,用GenBank/GenPept、EMBL/SWISS-PROT and FASTAASCII等格式输入的分子都能显示出序列和结构图,但自己手动粘贴的没有,需要再编辑。方法二:质粒图谱的网站http://www.addgene.org/http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector.htmlhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ebi.ac.uk/方法三:经过改造过的质粒上述方法不能查询到改造过后的质粒图谱。我们可以在文献中搜索该质粒的名称,进而了解到质粒具体信息。 4. 构建载体避坑说起连载体那真的是真的是一把心酸泪啊!当年载体连不上的那些场景,至今还历历在目,索性把踩过的雷全部翻出来讲给师弟,也好让他以后构起载体来省事一点(可能实际上并没什么卵用)。1)设计引物,在5’端加保护碱基哇,当年没加之前做了好久都做不出来啊,我的天。保护碱基的目的是为了PCR产物酶切的过程中,避免内切酶的空间位阻。或者另一种方法是,把片段连接在T载体上,不加保护碱基也行。2)观察载体上的酶切位点构载体之前好好检查一下,质粒图谱上是否存在设计的酶切位点,存在几个。如果没有,要尽早更换酶切位点。然而我当年构载体的时候,发现自己的片段里面也有酶切位点,还有好几个,更有甚者,高效的内切酶还都给我切开了,苍天呐!