【课题套路】国自然中转录因子还可以这样研究
什么是转录因子（TranscriptionFactors, TFs）？转录因子是指能够与目的基因的5’端特定序列特异性结合，从而调控基因转录表达的一类蛋白质分子。基因的转录表达驱动着一系列的细胞活动，而基因表达的强度受转录因子的影响，因此我们通常将对转录因子的研究视为基因的上游调控研究。
2019年以“转录因子”为主题的国自然中标项目中，医学科学部有76个中标项目，总资助金额达3269.5万元，足可见转录因子研究在国自然中的热门程度。那么国自然中转录因子会如何研究呢？今天要给大家分享的这篇文章比较有意思，文章于2019年发表在Cell Death & Differentiation上，名为“Downregulationof FOXO3a by DNMT1 promotes breast cancer stem cell properties andtumorigenesis”，文章研究发现乳腺癌中受甲基化转移酶DNMT1调控的转录因子FOXO3a可以负调控另一转录因子FOXM1的表达，FOXO3a和FOXM1以相反的调控方式内源竞争调控靶基因SOX2的表达，SOX2又能反馈调节DNMT1的表达，从而形成一个反馈调节通路。
一、立项依据
乳腺癌是女性最常见的癌症，是女性癌症死亡的第二大原因。尽管过去几十年里早期诊断和有效治疗措施明显改善了患者的预后，但仍有相当一部分患者对目前的化疗具有一定的抗性。乳腺癌干细胞（BCSC）是一种具有自我更新能力的肿瘤起始细胞，由于其固有的干细胞样特性，BCSC在肿瘤进展和治疗耐药性中起着重要作用，而常规化疗无法根除BCSC，经常导致乳腺癌治疗失败。因此，了解BCSC的调控机制有助于制定新的靶向消除BCSC的策略，从而提高乳腺癌患者的临床疗效。
FOXO3a是FOXO蛋白家族的转录因子，已被证实是细胞周期进程，细胞凋亡，转移，血管生成和代谢相关重要蛋白的重要转录调节因子。在人类的许多癌症中，FOXO3a的下调导致肿瘤的发生发展和不良预后。此外，一些研究表明FOXO3a在调节肿瘤干细胞（CSC）特性中起着重要作用，FOXO3a的过表达或药理激活抑制了干细胞样特性和肿瘤的发生，并抑制了肺癌和结直肠癌细胞的耐药性。最近有研究表明FOXO3a与乳腺癌的发生有关。然而，FOXO3a在BCSCs中的生物学功能和详细的分子机制尚不清楚，有待进一步研究。
为探究FOXO3a参与调控BCSCs特性的具体分子机制，制定靶向消除BCSC的治疗策略，研究人员进行了如下预实验：
1. DNMT1调控FOXO3a的表达
研究人员首先利用qRT-PCR和WB检测了乳腺癌细胞系中FOXO3a的mRNA和蛋白表达水平，并对20组乳腺癌组织中的FOXO3a进行mRNA表达量分析，结果均显示FOXO3a在乳腺癌中低表达。基于已有的认识，即FOXO3a的表达受其启动子DNA甲基化状态调控，研究人员利用亚硫酸氢盐测序分析了FOXO3a启动子的甲基化水平，随后利用脱甲基药物5-AzaC处理，确定FOXO3a启动子的高甲基化与其表达量负相关。敲减各种DNA甲基化转移酶（DNMT），随后过表达DNMT1，确定DNMT1负调控FOXO3a的表达。
2. FOXO3a抑制下游分子FOXM1的表达
有文献报道称FOXM1在维持CSC的自我更新和致瘤潜力中起着至关重要的作用，而FOXO3a可以与FOXM1的启动子结合以抑制其转录。为确定FOXO3a是否通过调控FOXM1影响BCSC特性，研究人员利用WB检测了敲减/过表达FOXO3a后FOXM1蛋白的变化，结果显示两者表达负调控。
3. FOXO3a/FOXM1调控下游分子SOX2的表达
为进一步确定FOXO3a/FOXM1是如何调控乳腺癌细胞干性的，研究人员分析了敲减/过表达FOXO3a后干性相关基因的表达变化，结果显示SOX2显著变化。敲减FOXM1，能逆转敲减FOXO3a引起的SOX2 mRNA和蛋白水平变化。敲减SOX2，FOXO3a mRNA表达显著增强。
4. SOX2激活DNMT1反馈抑制FOXO3的表达
考虑到敲减SOX2，FOXO3a mRNA表达显著增强，研究人员推测FOXO3a可能受SOX2调控。敲减/过表达SOX2后，FOXO3a的表达变化。根据文献报道，SOX2与DNMT1启动子结合以诱导DNMT1表达，研究人员过表达了SOX2，结果显示DNMT1的mRNA和蛋白水平均升高，敲减DNMT1，则能逆转这一现象。
因此，基于以上预实验结果，研究人员提出如下科学假说：DNMT1介导的FOXO3a启动子高甲基化导致乳腺癌中FOXO3a表达的下调，FOXO3a在功能上可以通过抑制FOXM1 / SOX2信号，进而抑制BCSC的干性和致瘤性。此外，SOX2可以直接激活DNMT1表达，从而反馈抑制了FOXO3a的表达。
科学假说图
二、研究内容
1. 体内外验证FOXO3a抑制BCSC的特性
1）体外验证：CD44high/CD24−/low细胞群比例和醛脱氢酶（ALDH）活性是BCSC的两个重要指标。分析发现CD44high细胞中FOXO3a表达更低，利用慢病毒载体或pCMV载体过表达FOXO3a，流式细胞仪分析显示 CD44high/CD24−/low细胞群显著减少，ALDEFLUOR分析显示ALDH+细胞的百分比显著降低，乳腺癌成球实验表明CSC的成球和非锚定生长均受到明显抑制。敲减FOXO3a，则上述现象相反。
2）体内验证：肿瘤起始能力是CSC的另一个标志属性，研究人员分析了FOXO3a在乳腺癌细胞肿瘤启动中的作用，裸鼠中皮下注射FOXO3a过表达的细胞，结果显示，肿瘤起始细胞（TIC）频率显著降低，肿瘤生长受到抑制，CD44和ALDH1水平明显下调。敲减FOXO3a，细胞致瘤性增强，肿瘤生长加速，CD44和ALDH1的水平上调。
2. FOXO3a/FOXM1轴调节BCSC特性
为确定FOXO3a 是否通过 FOXM1调节BCSC的干性，研究人员进行了功能回复实验，结果显示敲减FOXM1，能显著逆转敲减FOXO3a对CD44+/CD24-细胞群和ALDH+细胞百分比的积极作用，降低CSC的成球和不依赖锚定的生长。
3. FOXO3a/FOXM1轴通过sox2调控BCSC特性
1）为进一步阐明了FOXO3a/FOXM1轴是如何调节SOX2表达，研究人员分别在MDA-MB-231细胞中使用抗FOXO3a和抗FOXM1抗体进行了染色质免疫沉淀（ChIP）联合qPCR分析，结果显示FOXO3a和FOXM1都可以结合到SOX2的三个核心启动子区。敲低FOXO3a导致FOXM1与FHREs的结合增加，而FOXO3a的过表达显着抑制了FOXM1与FHREs的结合。荧光素酶报告基因检测结果表明FOXO3a和FOXM1均可以直接与SOX2启动子结合，且行使相反的作用。
2）为确定SOX2是否参与调控BCSC特性，研究人员进行了功能回复实验，结果显示敲减SOX2能显著逆转敲减FOXO3a引起的CD44+/CD24-细胞的数量和ALDH+细胞的百分比变化，CSC的成球和不依赖锚定的生长能力变化。
4. 分析DNMT1/FOXO3a/FOXM1/SOX2信号的临床意义
为确定DNMT1/FOXO3a/FOXM1/SOX2信号在乳腺癌中的临床意义，研究人员检测了20个原发乳腺癌组织中DNMT1，FOXM1和SOX2的mRNA表达水平，并通过免疫组织化学比较原发性乳腺癌组织和正常组织中各RNA的表达相关性，结果显示FOXO3a和FOXM1/SOX2/DNMT1表达水平之间存在显著负相关，而FOXM1，SOX2和DNMT1之间存在显著正相关。
5. 抑制DNMT1活性可通过FOXO3a/FOXM1/SOX2信号通路抑制肿瘤发生发展
因为DNMT1介导的甲基化下调了FOXO3a的表达，所以研究人员想要了解抑制DNMT1是否可以通过调节FOXO3a/FOXM1/SOX2信号传导来抑制肿瘤发生发展。
1）研究发现5-AzaC处理显著抑制FOXM1和SOX2的表达，而敲减FOXO3a，能逆转5-AzaC处理引起的FOXM1和SOX2的表达变化，同时研究发现CSC成球能力增强。
2）5-AzaC处理裸鼠，结果显示肿瘤生长能力减弱，敲低FOXO3a逆转了5-AzaC对MDA-MB-231肿瘤异种移植物生长的抑制作用。免疫组织化学染色显示5-AzaC处理显著增强了异种移植肿瘤中FOXO3a的表达，但降低了FOXM1和SOX2的表达。
三、技术路线
四、研究目标
1. 阐明FOXO3a通过调控BCSC的干性和致瘤性进而影响乳腺癌的发生发展；
2. 阐明DNMT1/FOXO3a/FOXM1/SOX2轴调控BCSC特性的具体分子机制；
3. 证明靶向抑制DNMT1活性对于抑制乳腺癌发生发展的可行性和有效性。
五、特色与创新之处
1. FOXO3a和FOXM1是在癌症进展中具有拮抗作用的两个叉形头转录因子，FOXO3a发挥典型的肿瘤抑制作用，而FOXM1是有效的癌基因。文章揭示了两者之间的调控关系，为后续的转录因子研究开拓了新的思路；
2. DNMT1负调控FOXO3a的表达，FOXO3a与FOXM1竞争调控SOX2的表达，而SOX2正调控DNMT1的表达，正好形成了一个反馈调节通路，全面阐述了乳腺癌中BCSC的全新调控机制；
3. 基于BCSC调控机制，靶向抑制DNMT1的活性，降低BCSC的干性和致瘤性，为临床靶向治疗提供新策略。
六、总结
文章从报道较多的转录因子FOXO3a出发，探索其在BCSC干性和致瘤性中可能行使的功能作用。文章假说的提出包括预实验的设计，很大程度上是参考了已有的文献报道，包括“FOXO3a可以与FOXM1的启动子结合以抑制其转录”，“SOX2与DNMT1启动子结合以诱导DNMT1表达”，这两个关键知识点的利用为FOXO3a反馈调节通路的提出提供了可能性，既一定程度上缩减项目的实验工作量，又充分做到了引经据典，可见在科学研究过程中“多读多看”文献有时候真的可以做到事半功倍。文章思路清晰，通过大量的生物实验加临床分析确定了可以通过抑制DNMT1活性，进而调节FOXO3a/FOXM1/SOX2信号传导影响BCSC活性，抑制肿瘤生长，为乳腺癌的临床治疗提供了新的策略。
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