【课题套路】来看看教科书式的PD-1研究

大家好，我是已经想不出能用什么开场白的无花果。

上个礼拜无花果给大家分析了一篇Nature的大神之作，说的是一反常态的肿瘤免疫研究（什么？上次错过了？没关系，赶紧戳→【课题反套路】别再用外泌体了，Nature教你肿瘤免疫新角度）。有的小伙伴会说我们没法儿和大神比，这种创新点根本借鉴不来。那么这次无花果就给大家推荐一篇中规中矩，但也能发表在高水平期刊的肿瘤免疫文章：

这篇文章于9月9日发表于Science子刊Science Translational Medicine（IF=16.304），是一篇通过经典思路、经典技术完成的教科书式研究论文，无论在课题思路还是实验设计上都有诸多可借鉴之处，让我们一起来看一看吧。

PD-1治疗大家已经很熟悉了，现在对PD-1的研究一般集中于PD-1/PD-L1药物的抵抗机制，如何提高PD-1/PD-L1敏感性等。本文也不例外。然而本文的研究策略很聪明，既从课题组的优势方向出发（看看本文的作者署名和单位数量，你会相当惊讶），又整合了各种数据库的资源，可以说把套路发挥到了最大化，而且与临床结合非常密切，有利于后续的药物研发和临床应用。

套路一：选择主角基因（KDM5A），生信分析肿瘤RNAseq数据，找到KDM5A标记物与PD-1治疗响应的关系（临床分析）

这里做的生信分析用的全部是已有数据，以为平平无奇？那就错了，作者分别使用了LMC、TCGA中的共6组数据来分别分析KDM5A在黑色素瘤中的相关富集基因、这些基因（KDM5A标记）与PD-1治疗响应的关系以及验证这些基因的标记作用，完整而严谨，不夸张地说，这套分析单拿出来都可以发个生信的小文章了。

套路二：动物模型验证在黑色素瘤和结肠癌中KDM5A增强PD-1治疗敏感性

将KDM5A过表达的B16或MC38细胞（对PD-1治疗抵抗）接种小鼠并使用PD-1抗体治疗，肿瘤体积显著小于对照组。

套路三：分子实验验证KDM5A提高PD-1治疗敏感型分子机制

KDM5A过表达肿瘤细胞中PD-L1表达量升高，为了深入研究KDM5A如何调控这一过程，作者做了一个蛋白组分析，发现PI3K-AKT-S6K1通路基因显著变化。接下来又做了ChIP确定KDM5A结合PTEN启动子并下调基因表达。然后就是常规的RT-qPCR、WB检测和细胞回复实验验证KDM5A通过下调PTEN上调PI3K-AKT-S6K1通路，从而提高PD-L1。

套路四：小分子化合物筛选发现D18提高KDM5A表达（本文的最大亮点来啦！）

本文比较特别的地方就是用到了小分子化合物库筛选。一般这样的方法都比较常见于临床应用研究。作者先通过2个化合物库筛选能够同时提高KDM4A和PD-L1的小分子，结果找到了已经用于临床的抗肿瘤药物帕博西尼（palbociclib）。

作者显然不满足于此，又用TLR7/8激动剂分子库筛选，最终找到了化合物D18。为什么要用这个库筛选呢？首先，这个库是作者实验室已有的分子库，在之前的研究中已经发现TLR7/8激动剂与ICB联用有良好的效果；其次TLR（Toll样受体）主要表达于免疫细胞表面，筛选得到的化合物很有可能同时影响肿瘤细胞和免疫细胞，此乃一箭双雕。

最终通过体外细胞实验和功能回复实验，验证D18对KDM5A、PTEN、PI3K-AKT-S6K1通路蛋白的影响，又通过HEK-Blue细胞、MyD88缺失的巨噬细胞和DC细胞验证D18对TLR7/8的作用。

套路五 动物模型实验验证D18与PD-1抗体联合使用效果

接下来的部分主要在于验证D18在体内的功能，这一部分更接近于临床。

第一步先对四种肿瘤模型小鼠进行单使用D18和联合使用D18/PD-1抗体，结果联合用药组效果最好；

第二步用流式细胞仪检测肿瘤组织中的细胞类型以及免疫细胞活化情况，证明D18+PD-1抗体能促进CD8+和CD4+T细胞活性；

检测一下抗原提呈细胞（DC细胞和巨噬细胞）：

最后发现D18和其他的免疫检查点治疗（TIM-3抗体）联用也有效。 

总结

其实这篇文章说容易也容易，说难也难。

容易的点在于分子机理并不复杂，重点也是放在化合物的筛选、体内外功能验证上。

然而更值得关注的还是本文在套路机制下的创新点（真正的难点），也就是从同时作用于肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞的角度出发，选择KDM5A这样比较上游的去甲基化酶作为主角分子，从而使整篇文章简洁而不简单，还具有很强的临床意义。

这就告诉我们，经典机制≠机制简单，中规中矩≠没有亮点。

可以说，这是无花果读过的比较适合临床医学的一种科研思路：立足于一个主角分子，选择一条经典已知的信号通路，通过适当的筛选深化临床意义。

有任何想看无花果解读的课题套路与反套路方向，欢迎在后台留言哦~

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