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【课题反套路】免疫应答与泛素化,它们怎么勾搭上了!

Linlin 科研讲坛 2021-02-21




Hi,大家好啊,我是一周出场一次的Linlin!

最近肿瘤的免疫研究相当火热,相关的研究论文数量可谓井喷式增长,看多了肿瘤免疫会不会感觉有点眼花,那么除了肿瘤免疫,是否可以考虑考虑其他的免疫研究方向呢?今天要给大家分享的是一篇将研究热点泛素化宿主的病原菌免疫应答相结合的文章,文章发表在大CDD(Cell Death and Differentiation)上,通过精妙的实验设计证明了E3泛素连接酶RNF220介导的STAT1泛素化对STAT1的激活和宿主先天性免疫应答起重要作用。


研究背景
1型干扰素(
IFN-α)信号对于宿主抵抗病原体感染和自身免疫性疾病至关重要。IFN-α可以激活IFN-α受体(IFNAR),并诱导下游JAK激酶介导的STAT蛋白磷酸化。STAT1调节多种细胞类型中1型和2型IFN受体(IFN-γ)以及许多其他细胞因子受体下游的各种生物学效应,STAT1活性在多种水平上对不同种类的病原体感染有严格的调节。RNF220是一种RING域E3泛素连接酶,作者先前已经对RNF220进行了一定的发育和信号传导相关的研究,但对于病原体感染期间RNF220在先天免疫应答中的作用未有了解,因此作者对其展开了相应的一系列研究。
研究内容

为确定RNF220在宿主免疫应答中的作用,作者首先检测了致病性病菌感染(鲍曼不动杆菌)和配体刺激(LPS,Poly(I:C),IFN-γ)条件下RNF220的mRNA和蛋白表达量,发现表达均增加,并在RNF220启动子区鉴定到了几个ISRE(IFN-α刺激反应元件)和GAS(IFN-γ激活序列)元件。为确定IFN-α信号传导对于Rnf220的表达是否至关重要(好吧,作者能够通过ISRE和GAS联想到IFN-α,Linlin还是很佩服的,毕竟它们中间还是有些过程的),作者敲减了IFN-α,发现RNF220的表达显著降低。


为确定RNF220与IFN-α之间的调控关系,作者构建了RNF220杂合基因敲除小鼠(纯合敲除小鼠具有胚胎致死表型,然后用病菌感染,配体刺激,发现IFN-α下游分子表达均显著降低。作者又进一步进行了RNF220纯合敲除的细胞实验,进一步验证了上述实验结果,提示RNF220调控IFN-α相关基因的表达。 


为确定RNF220调控的靶基因,作者进行了co-IP及反向IP实验,证实了RNF220和STAT1之间的相互作用,且研究发现STAT1的磷酸化显著降低,进一步分析发现STAT1的SH2结构域是其与RNF220相互作用所必需的。

 至此作者已经确定RNF220能与STAT1相互作用并影响其磷酸化。已知RNF220是E3泛素连接酶,那么它是否会介导STAT1的泛素化,因此作者对泛素化位点进行了特异性分析,并通过位点突变等实验,证实RNF220特异性介导STAT1的K63连接的多聚泛素化。随后,作者进行了STAT1截短突变体分析,确定RNF220在K110介导STAT1 K63的多聚泛素化(这里的泛素化和我们平时常见的泛素化不同,具有促进稳定性而非降解的作用)。


已有研究表明STAT1 K63连接的多聚泛素化对于STAT1磷酸化及其DNA结合活性很重要,因此作者分析了RNF220介导的多聚泛素化是否有同样的效果。通过co-IP及STAT1 K110突变实验,发现RNF220确实促进了STAT1和JAK1之间的相互作用,而K63-泛素化进一步增强了它们的相互作用,表明RNF220介导的STAT1的K63连接多聚泛素化有助于STAT1磷酸化。


在研究完RNF220对IFN-α信号传导的影响之后,作者又进行了其对IFN-γ的信号传导的影响,同时分析确定病菌感染过程中RNF220可以通过IFN-γ信号传递到泛素化的同源STAT1二聚体,从而使宿主行使防御作用。


最后,作者利用小鼠分析了RNF220在抵抗病菌感染的宿主防御中的作用,确定RNF220通过介导STAT1的K63连接的多聚泛素化,通过正反馈回路增加IFN-α和IFN-γ信号传递,从而促进宿主抵抗病原菌感染。


假说图


总结

单从假说图来看,就知道这篇文章不简单啊,工程很是庞大,对于作者这样的课题设计不得不竖起大拇指。首先作者的研究切入点就非常有新颖,将泛素连接酶与病原菌感染后的免疫应答联系起来,这一点一般人还真的很难想到。更巧的是作者进行了精妙的实验设计,并充分结合了已有文献报道结果,分析发现RNF220通过正反馈回路促进STAT1的泛素化和磷酸化。对于泛素化,我们惯有的思维是泛素化后蛋白通常就会被降解掉,这篇文章给了我们完全不一样的见解,跳出常规的思维套路,发现不一样的新大陆。


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