一文囊括国自然两大热点！快来看看泛素化修饰与铁死亡要怎么完整验证

铁死亡（Ferroptosis）是近年来新发现的一种细胞程序性死亡类型，区别于我们熟知的细胞凋亡（Apoptosis)、坏死（Necroptosis）、焦亡（Pyroptosis）、自噬性死亡（Autophagic cell death），通过铁依赖的磷脂过氧化过程引发细胞膜的破损，从而诱导细胞死亡。研究表明，肿瘤细胞，尤其是耐药细胞对铁死亡更为敏感，是潜在的药物靶点。

铁死亡机制示意图（图片来源于《Cell》）

1. 引言

铁死亡一经发现迅速成为国自然的新宠，这两年在国自然医学部的中标数成倍增长，笔者预计今年中标的铁死亡相关研究很可能会突破百项！作为一个肿瘤与非肿瘤疾病均可以作为细胞功能着眼点的程序性死亡机制，铁死亡无疑在今后几年继续维持稳步上升势头，那么铁死亡怎么做才能够完善和高大上？国自然如果想申报铁死亡相关项目又要深入到什么程度呢？别着急，下面这篇文章可以给你一个答案...

过往的研究发现铁死亡过程与胞浆中的活性氧代谢密切相关，线粒体外膜上的离子通道VDACs能调节线粒体内外的活性氧平衡。erastin作为铁死亡的激活剂，能通过结合谷胱甘肽（GSH）转运体或VDACs蛋白，提高细胞内的活性氧水平，有效诱导肿瘤细胞的铁死亡过程。然而，使用erastin一段时间后肿瘤细胞对其敏感度降低，即产生耐药性，其中的机制尚不清楚。

2. 科学假说与研究意义

2020年1月23日北京理工大学杨勇飞团队和军事医学研究院陈薇团队在《Nature Communication》上联合发表了题为Nedd4 Ubiquitylates VDAC2/3 to Suppress Erastin-Induced Ferroptosis in Melanoma的研究，揭示了在黑色素瘤中，Nedd4通过泛素化降解VDAC2/3（线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道蛋白，与erastin结合后改变线粒体膜通透性，从而诱导铁死亡），抑制erastin诱导的铁死亡机制。这一发现有望使Nedd4成为新型的黑色素瘤治疗靶点。

科学假说图

3. 结果展示

为了验证该假说，本文主要从五个大的研究目的进行展开：

（1）Erastin引发黑色素瘤细胞内VDAC2/3的泛素化降解过程

对黑色素瘤细胞进行Erastin处理后，VDAC2/3蛋白含量较处理前显著降低，VDAC2/3蛋白泛素化水平显著升高。（蛋白酶体抑制剂、蛋白合成抑制剂、泛素单克隆抗体是研究蛋白存在泛素化修饰的“三叉戟”）

（2）泛素化连接酶Nedd4通过结合特异的氨基酸位点负调控VDAC2/3蛋白质稳定性

 1）目标基因确定：为了寻找引起VDAC2/3泛素化降解的酶，对VDAC2/3的氨基酸序列进行比对，发现其中具有序列保守性的PPxY结构域。通过UbiBrowser数据库预测，找到泛素化连接酶Nedd4。（一个非常好用的泛素酶预测神器，给大家附上网址：http://ubibrowser.ncpsb.org/ubibrowser/）

2）目标基因功能验证：在黑色素瘤细胞中表达正常以及泛素化连接位点突变的Nedd4，并用Co-IP和Pull down实验检测VDAC2/3蛋白表达水平和泛素化水平。随着Nedd4含量增加，VDAC2/3蛋白量下降，泛素化水平升高。突变的Nedd4对VDAC2/3蛋白和泛素化水平均无影响。（一般国自然想研究泛素化修饰，也要构建泛素酶的失活突变体）

3）作用位点验证：将VDAC2/3泛素化位点氨基酸突变后重复上述实验，VDAC2/3的蛋白量和泛素化水平不再受到Nedd4的影响。细胞内实验表明，VDAC2/3表达被抑制或泛素化位点突变后，erastin处理不引起VDAC2/3降解，肿瘤细胞对erastin的敏感性恢复。

（3）Nedd4抑制erastin诱导的铁死亡

    分别在黑色素瘤细胞中RNA干扰和过表达Nedd4，检测细胞活力、膜脂过氧化水平、MDA含量、铁离子含量、GSH和GSSG水平等铁死亡指标。相比对照组，抑制Nedd4表达能有效回复erastin诱导的铁死亡过程，而增强Nedd4的表达阻碍erastin诱导铁死亡。（这些铁死亡的marker蛋白和指标大家要记住哦，设计相关实验的时候这是必需品）

（4）erastin通过转录因子FOXM1激活Nedd4表达

1）FOXM1对Nedd4的调控作用：有研究指出Nedd4受到转录因子FOXM1的直接调控，而ROS能激活FOXM1的表达。在Nedd4启动子区找到FOXM1结合位点，用ChIP和荧光素酶报告基因实验证明FOXM1对Nedd4确实存在正调控作用。（作者真的是做了一个长线研究，一般国自然做到泛素酶就可以了）

2）FOXM1参与erastin诱导的VDAC2/3降解：在黑色素瘤细胞中RNA干扰FOXM1的表达，Erastin处理后检测CDAC2/3蛋白水平和铁死亡相关指标。抑制FOXM1有效阻碍erastin诱导的VDAC2/3降解，同时表达Nedd4则能部分回复降解作用。（万能且必要的挽救实验）

（5）抑制Nedd4提高黑色素瘤细胞对erastin的敏感性

分别在A375和G-361两种黑色素瘤中敲减Nedd4的表达，并种植于裸鼠皮下。erastin处理后，细胞群落实验显示肿瘤细胞数量显著降低，裸鼠皮下肿瘤体积明显缩小，MDA和GSH含量升高，说明肿瘤细胞内活性氧积累导致细胞死亡。

4. 总结

本研究结合了铁死亡和泛素化修饰两大研究热点，从erastin的药物敏感性下降这一临床问题入手，找到参与调控线粒体离子通道蛋白VDAC2/3的关键泛素化连接酶Nedd4，并阐明erastin诱导VDAC2/3降解阻碍铁死亡，产生耐药性的通路机制，具有重要的临床意义。全文思路简洁清晰，从药物-转录因子-泛素酶-底物蛋白降解-铁死亡这一中心轴出发，完整但不累赘的验证完了整个思路，每一步逻辑紧密、环环相扣，是大家申请基金的一篇良好模板，全面验证不等于堆砌数据，望大家在撰写文章与基金的时候谨记这一点！

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