mRNA加帽生物学功能和应用

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所有真核生物 mRNA 都包含一个帽结构 - 一种 N7 甲基化鸟苷，通过反向 5' 到 5' 三磷酸键连接到 RNA 的第一个核苷酸（图1）。mRNA 帽子可以充当保护结构，阻止 5' 到 3' 外切核酸酶的切割，此外帽子结构是启动蛋白质合成的结构，同时也是前 mRNA 剪接、聚腺苷酸化和核输出募集蛋白质因子的唯一标识，它还充当募集起始因子的锚，这些起始因子启动蛋白质合成和翻译过程。

核 RNA 加帽

RNA 聚合酶 II 转录合成的 RNA 进行的第一次修饰就是加帽，一旦前 25-30 个核苷酸被整合到新产生的转录物中，就会在细胞核中进行共转录。产生 cap 0 结构需要三种酶活性，即 RNA 三磷酸酶 (TPase)、RNA 鸟苷酸转移酶 (GTase) 和鸟嘌呤-N7 甲基转移酶 (鸟嘌呤-N7 MTase)，这些酶在cap 0 结构的产生过程中发挥重要作用。RNA TPase 去除 5' 三磷酸中的 γ-磷酸，生成 5' 二磷酸 RNA（图1, 反应 1)。GTase 通过赖氨酸-GMP 共价中间体将 GMP 基团从 GTP 转移到 5' 二磷酸（图1，反应 2.1 和 2.2）。然后鸟嘌呤-N7 MTase 将甲基添加到鸟嘌呤帽的 N7 胺中以形成帽 0 结构（图1，反应 3）。此外，特异性 2'O 甲基转移酶 (2'O MTase) 使核糖 2'O 位置的 +1核糖核苷酸甲基化产生 cap 1 结构（图1，反应 4）。

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图1 参与 RNA 加帽的酶促反应步骤

细胞质RNA加帽

以前的研究认为加帽过程只发生在细胞核中，但最近的研究表明RNA 加帽过程也存在于哺乳动物细胞和锥虫的细胞质中。真核细胞在 P 体中以信使核糖核蛋白 (mRNP) 的形式在细胞质中维持未加帽的 mRNA 池，在那里可以进行 mRNA 的储存、去腺苷酸化和脱帽。P 体中未加帽的 mRNA 可以重新进入多核糖体并被翻译，对于不同的 mRNA，p 体中 mRNP 的 poly(A) 尾的长度可以变得更短、更长或不变，并且重新进入 polysome 的能力取决于帽子结构的存在与否而不是 poly(A)尾巴的长度。细胞质重新加帽系统可能代表一种新的 mRNA 失活-再激活机制，有助于调节蛋白质合成。对内部 CAGE 位点和 PASR 等非编码 RNA 的重新加帽表明，帽子结构在蛋白质产物的多样性和调控网络中分别发挥了巨大作用。

参与 RNA 加帽的酶活性

RNA三磷酸酶活性

RNA 三磷酸酶，归类于多核苷酸 5'-磷酸酶 (EC 3.1.3.33)，将多核糖核苷酸的末端三磷酸转化为二磷酸，也可在在体外将核糖核苷三磷酸水解为二磷酸。RNA TPases 包含半胱氨酸磷酸酶超家族的保守 HCXXXXXR(S/T) 基序，包括蛋白酪氨酸磷酸酶和磷酸肌醇磷酸酶。保守的半胱氨酸位于深裂底部附近，并在 β-γ 磷酸酐键断裂期间与 γ-磷酸形成共价半胱氨酰磷酸酶中间体。活性位点的深裂区域可以使酶区分末端 5' 三磷酸和 RNA 的 5' 二磷酸。

在哺乳动物中，RNA 三磷酸酶不依赖于二价金属离子，并且总是与双功能蛋白（小鼠中的 Mce1；哺乳动物中通常称为 RNA 鸟苷酸转移酶和 5'-三磷酸酶 RNGTT）中的 GTase 活性物连接。 低等真核生物的 RNA TPase 和大多数 DNA 病毒加帽酶依赖于二价金属离子进行催化。这些 TPases 共享一个 β-桶隧道结构，在该结构中发生催化反应。

RNA鸟苷酸转移酶活性

RNA 鸟苷酸转移酶，正式名称为 GTP-RNA 鸟苷酸转移酶 (EC2.7.7.50)，将 GMP 部分从 GTP 转移到 TPase 处理的 RNA 的 5' 二磷酸，形成加帽的 5' 末端。RNA GTases 属于核苷酸转移酶亚家族，包括 ATP 和 NAD +依赖性 DNA 连接酶。这类核苷酸转移酶在生命的所有领域在结构和机械上都是保守的。它们通过两步机制催化核酸连接，包括赖氨酰-Nζ-连接的共价中间体和 5'-5' 磷酸（脱氧）核糖产物的形成。

对于 RNA GTase，Kx(D/N)G 基序中的赖氨酸残基对 GTP 的 α-磷酸进行亲核攻击，破坏 α-β 磷酸酐键并形成共价赖氨酰-Nζ-GMP 中间体（图1, 反应 2.1)。然后将 GMP 部分转移到 5' 二磷酸上，形成加帽的 G(5')ppp(5')RNA（图1，反应 2.2）。GTase 反应让人想起由 ATP 和 NAD +依赖性 DNA 连接酶（DNA 5' 腺苷酸化）催化的反应的前两个步骤。在形成共价赖氨酰-Nζ-AMP 中间体后，这些连接酶将 AMP 部分转移到 DNA 的 5' 单磷酸盐上，形成腺苷酸化的 A(5')pp(5')DNA。

RNA鸟嘌呤-N7甲基转移酶活性

鸟嘌呤-N7 MTase (EC 2.1.1.56) 催化甲基从 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 转移到 GpppRNA 以形成 m7GpppRNA 和 S-腺苷同型半胱氨酸 (SAH)（反应 3，图1）。RNA 鸟嘌呤-N7 MTase 被归类为罗斯曼折叠甲基转移酶 (RFM)，因为 SAM 结合域在结构上类似于罗斯曼折叠 。甲基的转移被认为经历了经典的 SN 2 机制，例如环外胺 DNA 甲基转移酶。SAM 的硫键甲基碳正离子充当强亲电试剂，而鸟苷帽 N7 位的伯胺是亲核试剂。

病毒多功能加帽酶

一些病毒加帽酶如牛痘病毒加帽酶和蓝舌病毒加帽酶整合了 RNA 加帽的所有必要酶，在单个多肽中生成 cap 0 或 cap 1。牛痘病毒是痘病毒科的原型病毒，编码由大亚基 D1 和小亚基 D12 组成的异二聚体 RNA 加帽酶。尽管产生 cap 0 所需的所有三种酶活性都位于 D1 中，但鸟嘌呤-N7 MTase 活性需要与 D12 结合才能有效发挥作用。结构和生化数据表明，D12 与鸟嘌呤-N7 MTase 结构域的相互作用诱导了有效催化所必需的构象变化。牛痘加帽酶的结构表明，三种酶活性按照从 N 端到 C 端的 TPase、GTase 和鸟嘌呤-N7 MTase 的顺序整齐排列为离散模块（图2A）。TPase 结构域包含三磷酸隧道金属酶 (TTM) 的 8 链 β 桶结构特征。

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图2 多功能 RNA 加帽酶 ( A ) 牛痘加帽酶结构（B）蓝舌病毒加帽酶VP4结构

蓝舌病毒加帽酶 VP4 整合所有 4 种酶活性以产生帽 1 结构。VP4蛋白质为细长形状，具有负责同二聚化的 N 端和 C 端结构域，是VP4 组装成病毒核心样颗粒所必需的。鸟嘌呤-N7 MTase 和 2'O MTase 与其他已知结构非常保守，但 RNA TPase 和 GTase 结构域不能明确的被识别。有研究表明负责赖氨酰-磷酸鸟苷中间体的赖氨酸定位在蛋白质 C 末端附近。然而，在 VP4 结构中没有发现保守的 GTase 折叠，且VP4 结构不包含病毒和原生动物加帽酶的 RNA TPase 活性特征的 β 桶隧道结构。相反，后生动物加帽装置的半胱氨酸磷酸酶特征的推定 HCXXXXXR(S/T) 基序发现GTase 活性位点在蛋白质 C 末端附近裂缝中。

RNA 加帽酶的应用

加帽酶可以在带有 5' 末端三磷酸或二磷酸基团的 RNA 上产生 cap 0 结构。如前几节所述，在体内有效翻译 mRNA 需要 cap 0 结构。牛痘加帽酶和 2'O MTase 已被用于在体外转录本上生成 cap 0 和 cap 1 结构，该酶也可用于转染真核细胞并驱动蛋白质合成。在体外产生 cap 0 和 cap 1 RNAs 的能力对于研究 G cap 及其 2'O 甲基化在先天免疫中的作用也非常宝贵。与翻译机制兼容的荧光标记 GTP 的新发展使荧光标记 RNA的体外合成成为可能 。使用与脱硫生物素偶联的 GTP 进行体外RNA 加帽，可以丰富细菌转录物以进行深度测序。

总结

虽然 mRNA 帽子结构是在 1970 年代发现的，但由于学者的不断深入，它们的生物学作用才得到更深入的了解。除了它在 mRNA 输出、mRNA 成熟和蛋白质合成中的作用外，对 RNA 帽子在先天免疫中的作用有助于推进合成 mRNA及其体内和治疗应用领域的发展。

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参考文献：

[1] Anand. R，mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research, Volume 44, Issue 16, 19 September 2016, Pages 7511-7526, https://doi.org/10.1093/nar/gkw551