细胞培养过程对单克隆抗体糖基化修饰的影响和调控

在单克隆抗体药生产过程中，其糖基化修饰可能受到多种工艺参数的影响，因而容易产生异质性，并且抗体糖基化和抗体半衰期、免疫源性、ADCC、CDC等密切相关，所以单克隆抗体的糖基化修饰是重要的质量属性，需要在生物药尤其是生物类似药开发过程中重点关注，并加以调控。通过概述培养过程中的细胞株、培养工艺，以及培养基对糖型的影响，讨论如何在工艺开发过程开展研究，确保产品糖基化的一致性，从而保证单抗药物的疗效及安全性。

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宿  主  细  胞

糖基化修饰高度依赖于细胞表达系统、选择的克隆细胞群以及培养过程(培养液等)。CHO细胞系和小鼠骨髓瘤细胞系(NS-0，SP2/0)已经成为治疗性单抗和Fc融合蛋白生产的金标准，哺乳动物宿主细胞、绝大多数细胞系均能适应悬浮生长反应器的培养。尽管多肽链的完整性在不同的表达系统和培养条件下看似不会发生变化，值得注意的是糖基化会发生的重大改变。糖基化随着细胞系和动物种属的变化而变化。哺乳动物细胞具有细胞内的糖基化装置，需根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。

CHO细胞糖基化的机制同人类的IgG糖基化作用机制十分相似，仅有一些微小的不同之处。据报道，人类的IgG末端唾液酸残基以α-2，6连接，然而CHO细胞来源的抗体以仅α-2，3连接。然而，无论是人类的IgG，还是CHO细胞来源的抗体，末端唾液酸残基的含量都很低(仅有不到5％的糖含有唾液酸残基)。因此，唾液酸残基连接的不同对产品的质量可能不会造成影响。而且，许多人类血清糖蛋白也含有α-2，3连接的唾液酸残基。

鼠源细胞系NS-0糖基化的机制表现出极大的不同之处(见下图)。一些糖基化水平的改变对产品的质量和生物学活性会产生极大的影响。大多数鼠源细胞系含有一种额外的糖基化酶，这种α-1，3半乳糖苷酶主要介导半乳糖残基从α构象的UDP-Gal转移到末端半乳糖残基上。人体内含有抗α半乳糖表位的抗体。另外，鼠源细胞系产生NGNA，而并不是产生NANA。NGNA和NANA的区别是NGNA有一个额外的氧原子。并且，糖蛋白中若含有NGNA残基，被认为与人体的免疫原性密切相关。一些已上市的治疗型糖蛋白因为含有NGNA残基而在患者体内引起严重的不良反应。

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培  养  工  艺

（一）pH

细胞培养工艺开发过程中，pH可能影响抗体半乳糖、岩藻糖、唾液酸等末端修饰，其中关于半乳糖末端修饰的研究最多，也最受关注。即有半乳糖随pH增加而增加的报道，也有半乳糖随pH增加而减少的报道，有研究称pH在6.8~7.2范围内，半乳糖化修饰水平随pH升高而降低；也有研究称pH在6.90~7.10范围内，G1F+G2F糖型随pH升高而增加，超过这个pH范围，糖型变化不大；另外pH对糖型的调节还需要综合其他因素，低氨浓度环境中6.9~8.2的pH范围对重组蛋白糖型影响不大。有人通过对比实验证明 pH对糖型的影响具有细胞株的特异性，因此pH值对半乳糖糖型的影响依据培养细胞和培养条件等的不同而表现出差异。pH值对唾液酸糖基化水平的影响也应当依据具体培养条件而具体分析，杂交瘤表达系统中发现pH值控制较高时(pH=7.8)，较pH 6.8时抗体的半乳糖化和唾液酸化的修饰水平均会降低一半左右，但同样也有唾液酸修饰水平和岩藻糖修饰水平与 pH值正相关的报道。

pCO₂（二氧化碳分压）和pH调节剂(NaOH、NaHCO₃、Na₂CO₃、HCl等)也会对糖型产生影响，有报道称随pCO₂增加多聚唾液酸和Neu5Ac减少，也有报道称高pCO₂培养环境中Neu5Gc含量降低而Neu5Ac变化不大，致使总的唾液酸化修饰降低。使用不同pH调节试剂时Na₂CO₃调节pH得到的唾液酸修饰水平比NaOH高，尤其是高唾液酸水平的糖型增加。

细胞培养过程中pH值影响抗体糖基化的原因，一般认为培养环境中的pH可以通过调控高尔基体的pH及铵离子(NH4⁺)的水平而影响糖基化相关酶的酶活性，进而影响了抗体糖基化，在工程细胞培养过程中，pH会造成产品糖基化修饰的变化，这种变化具有细胞株的特异性，也和培养基和培养工艺密切相关。此外，pCO₂水平的控制和碱性调节试剂的选择等都需要在培养工艺开发过程中进行关注和研究。

（二）溶氧(Dissolved oxygen，DO)

溶氧对抗体糖型的影响多集中在半乳糖残基的变化，有研究表明在杂交瘤细胞培养过程中设定不同的DO值(100%、50%、10%)条件GO(不含半乳糖残基)糖型随溶氧升高而降低，但50%和100%溶氧条件下差距不大，G2(含两个半乳糖残基)糖型含量则明显的随着溶氧升高而升高，G1(含一个半乳糖残基)糖型随溶氧变化总体变化不大。该变化产生的原因一般认为，低溶氧条件下半乳糖的前体物质UDP-Gal(尿苷二磷酸半乳糖)减少；并目低溶氧条件下氧化还原电位影响抗体二硫键的形成，而二硫键对半乳糖加入寡糖链会产生空间位阻效应。

溶氧控制测量和溶氧稳定也可能对抗体糖型造成影响。不同型号反应器即便设置相同DO值糖型还是会有变化，这是因为各个反应器由于通气设置方式相差较大，从而使达到同样DO水平的方式和溶氧波动方式产生不同。报道称，溶氧波动10%~90%变化时，抗体糖型末端半乳糖残基和唾液酸残基最大变化量分别达20%和30%；而低溶氧水平(10%)下，三天线结构糖型(高甘露糖)和末端唾液酸残基的糖型数量会增加。

有学者通过CHO细胞表达抗体时发现，在较大的溶氧范围和波动范围内，糖型G0、G1含量变化不大，表达量和申荷异质性也基本一致。所以，对于不同的细胞株和产物还是存在差异，在工艺设置时，应予以充分考虑。

（三）渗透压

研究表明用NaCl调节渗透压时，随着渗透压的增高，单抗的高甘露糖糖基化修饰逐渐增高，Man5的含量从15%增加到23%~27%。而GOF的含量则随着渗透压的升高而降低，G1F差异不大。推测渗透压对 Man5水平的影响可能是高渗透压条件导致GnT-I酶活性降低、mRNA翻译减少、GnT-I稳定性降低或糖基化途径上其他酶活性变化所致。

另有报道称，鼠杂交瘤细胞系YB2/0生产的抗体其岩藻糖修饰水平随着渗透压增高而降低。同时在pH和渗透压同时变化的情况下，低pH时，pH对糖型影响占主导地位；高pH时，糖型与渗透压变化相关性更大。同时有研究表明，Sp2/0细胞对渗透压联合pCO₂改变过程表现出较强的稳健性，整个糖型末端各种单糖残基的改变不超过±20%，但半乳糖残基在pCO₂(195mmHg)条件下，在不同培养基中随渗透压增高而降低；在pCO₂ (140mmHg) 条件下，在血清培养基中随渗透压升高而降低，无血清培养基中随渗透压升高而升高。因此,渗透压可能和其他参数条件共同在抗体糖型调节中起作用。

（四）温度

工程细胞培养过程中，降温可以提高抗体表达量。对于CHO细胞低温培养工艺对抗体糖型的影响，有研究表明低温培养策略显著减少唾液酸及半乳糖水平；但低温(30℃)与0~5mmol/L丁酸钠(NaBu)协同时，抗体唾液酸含量和生物学活性没有影响。而在不同初始谷氨酰胺浓度(0和4mmol/L)条件下，降温(初始低温、第三天降温)培养导致半乳糖修饰降低，唾液酸修饰增加。但一定范围内的温度(28.5℃~38.5℃)对于 IgM型抗体没有影响。

温度的降低会带来细胞代谢方式的改变，低温会减少细胞内核苷糖体供体数量，从而影响抗体Fc段糖基化比例。同时，通过降低抗体N-糖基化分支和延伸相关酶(比如半乳糖苷转移酶等)的活性减少末端半乳糖、岩藻糖等修饰的糖基化(比如GFG2F等)百分含量，增加不含半乳糖、岩藻糖等末端修饰的糖基化(比如GOGOF等)百分含量。

（五）培养基

培养基是细胞培养的基础，培养基优化也是质量调节和提高表达量的重要和有效手段。

葡萄糖除作为营养物质之外，还可以作为糖基化的前体糖-核苷酸存在。有研究称葡萄糖浓度偏低时(0-25mmol/L)葡萄糖将被细胞主要用来当做营养物质维持生存，而不被当做糖基化的前体物质，因而会导致产品的整体糖基化水平降低，并且非正常的糖基化结构产生增多。细胞培养过程中处于较高浓度范围的葡萄糖通常引起抗体的半乳糖和唾液酸的升高，其主要影响在培养的早期阶段，因为这个阶段多数糖基化调控的酶处于活跃表达时期。

半乳糖、Neu5Ac(N-乙酰神经氨酸，唾液酸)、尿苷和甘露糖等可以称为糖-核苷酸前体的原材料，可以在培养过程有目的的添加以提高特定前体物质含量，从而预测糖型走向。添加D-半乳糖可以提高胞内的 UDP-Gal含量，降低UDP-Glc，从而提高半乳糖糖基化修饰；添加氨基葡萄糖(GlcN)或N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)可以提高胞内的UDP-GlcNAc，从而提高甘露糖糖基化修饰，并降低糖型的复杂程度，此外，几夫碱的添加也有利于高甘露糖的增加；添加能够增加胞内CMP-NeuAc的水平的乙酰甘露糖胺或者半乳糖、尿苷、Mn²⁺、地塞米松可以提高蛋白产品末端唾液酸糖基化修饰。也有研究称，添加半乳糖、甜菜碱、Mn²⁺可使非岩藻糖修饰增加。

Cu²⁺单独使用可以降低单抗的岩藻糖和半乳糖修饰；Mn²⁺作为β-1,4-半乳糖苷转移酶的辅助因子，在一定范围内可以使单抗的半乳糖化和唾液酸化修饰增高，但Mn²⁺对糖型的影响，很大程度上需要培养基的其他成分协调作用，如Mn²⁺与尿苷、半乳糖协同作用可以提高单抗的半乳糖化修饰。

氨是糖基化调节的重要物质，氨水平的增加可以造成胞内高尔基体pH增高，从而影响UDP-GlcNAc和唾液酸的转运，同时引起半乳糖和唾液酸修饰的降低和甘露糖修饰的增加，除直接添加铵(NH₄⁺)外，还可以使用谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)等的额外添加，通过细胞培养的代谢，增加培养基中的氨，以达到调节糖型的目的。

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总    结

寻找关键工艺参数，并对其进行研究，找出控制范围，在实际生产过程严格控制，是获得批次间质量连续性和稳定性的必要步骤。对于单克隆抗体的糖基化修饰，不同细胞株或克隆对相同工艺参数和范围往往有不同的质量表现，目前工艺参数对糖型影响的理论和假设也无法对这些现象均给出满意的解释，每一个项目的工艺开发往往需要具体问题具体分析。本文通过相关文献总结了可能影响抗体糖型的各种因素及其影响糖型的原理，总结出抗体糖型调控的基本思路,希望梳理思路给抗体药工艺开发人员以启示。

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参考文献：

[1]单克隆抗体糖基化修饰研究进展，王冲，2012

[2]细胞培养过程对单克隆抗体糖基化修饰的影响和调控，江一帆，贾 宇， 王 龙，王志明，2016