SCIEX中国 · 唐恺： 高分辨质谱&毛细管电泳技术在寡核苷酸表征分析及定量中的应用 |【求实药谈】

NID 2021核酸药物产业发展论坛组委会有幸邀请到SCIEX中国生物制药市场开发经理 唐恺基于SCIEX在精准检测和化合物定量的丰富经验，以采访形式分享了质谱和毛细管电泳技术在寡核苷酸表征分析及定量中的应用，以及对于mRNA药物研发的支持和优势。

唐恺

SCIEX中国

生物制药市场开发经理

SCIEX公司生物制药行业开发经理，2009年硕士毕业于加拿大Concordia University，十年以上液质联用药物分析工作经验，对药物杂质分析，代谢物鉴定，生物制药表征分析有深入见解。

Q：治疗性寡核苷酸及mRNA作为一类新兴的治疗方式，其潜力不断被挖掘，并引领着全球研发浪潮，但由于寡核苷酸的体积大及容易合成加合物的特性，因此寡核苷酸的开发通常会严重依赖质谱分析和定量，现阶段对于寡核苷酸开发相关的质谱分析和定量有哪些进展？对于寡核苷酸药物研发来说有何影响？

在早期的寡核苷酸研究过程中，质谱的应用基本上是偏重于分子量的快速测定，以及定量分析。质谱是根据化合物质量数与电荷数的比值，将化合物加以区分的分析仪器，在生物制品的表征分析中扮演着重要的角色。最早期对寡核苷酸的分析，都是采用常规分辨率的质谱对其分子量进行精确到个位数的测定，判定是否得到目标寡核苷酸，也可以用三重四极杆质谱对其进行绝对定量。而现在，随着分析技术的飞速发展，高分辨质谱也进入了核酸表征分析的领域，对寡核苷酸而言，可以进行精确分子量的测定，核酸修饰（比如甲氧基化和氟化等）和杂质的定性定量分析，碱基序列的验证（类似于抗体药物的肽图）等等更加深入的表征分析工作。另外对于现在火热的mRNA类药物，高分辨质谱也将应用拓展到了加帽率和polyA分布的鉴定上来，给出更为精准的结构信息。

Q：对于核酸药物来说，除了液质联用高分辨质谱外，毛细管电泳技术在也是核酸药物表征分析及定量的重要新方法，从核酸药物生物制药表征分析来说，高分辨率质谱与毛细管电泳技术有哪些优缺点？

对于核酸药物与的表征分析来说，比起传统分析手段，高分辨质谱可以给出保留时间以外的精确分子量相关信息。传统意义上的液相色谱或者单位质量分辨质谱，受到保留时间和分子量相近因素的干扰，很难将寡核苷酸精确定性。而高分辨质谱可以给出精确到小数点后4-5位的质量数信息，对于区分结构相近杂质、代谢物，验证目标产物和碱基序列非常重要，这同样适用与mRNA加帽率和polyA分布的测试。对于绝对定量来说，质谱手段可以对血液基质中浓度低至ppb级别的核酸定量。当然质谱受到离子化效率，离子传输效率的影响，RSD值要远远大于液相色谱，一般来说我们认为15%以下是一个可接受的范围。毛细管电泳作为一种发展迅猛的分离分析技术，相较于传统的超高效液相色谱，具有分析时间短，分离效率高，适应性广，进样量少，自动化程度高等优势，在生物医药领域更是备受青睐。毛细管电泳同样可以进行寡核苷酸杂质分析，mRNA完整性、加帽率和polyA分布分析。毛细管电泳相较于液相色谱，仪器本身的价格略高。

Q：毛细管电泳技术可以研究寡核苷酸药物动力学，它的分辨率高，所需样本量少，但是分析时需要复杂繁琐的样品前处理步骤，对于这一技术性难题，贵司有哪些经验和策略？

样品前处理的繁琐与否，一般取决于样品本身的性质。对于前处理相对比较复杂的生物制品，在毛细管电泳上，我们都推出了相应的前处理试剂盒，这些试剂盒包括针对核酸药物的、抗体药物的、基因治疗产品等等。我们将其打包在一个前处理的kit当中，这类kit还包括了每一种类型样本所需的常用试剂，耗材和标准使用流程，这样最大限度地降低了操作者的前处理难度和人为误差，保证实验结果的准确性和重现性。提到分析通量，也是企业关注的重要话题，SCIEX刚刚推出了最新的毛细管电泳BioPhase 8800系统，该系统具备八个平行的通道，可以同时分析八个样本，提高通量的同时，每个通道的数据结果高度一致，为分析者提供了过程高效、结果稳定的数据。

Q：目前获批的寡核苷酸药物包括了2种机制：诱导目标mRNA的裂解；或改变mRNA前体的剪接模式。从您的经验来看，这两种机制下的寡核苷酸表征分析及定量是否会有哪些不同？

诱导mRNA裂解的寡核苷酸，能够将内源性的酶招募到药物与杂交的靶mRNA上；改变mRNA前体剪接的寡核苷酸在靠近剪接控制位点的部位与mRNA前体杂交，通过空间位阻作用，改变酶对mRNA前体的作用。这两种机制，对于寡核苷酸药物本身的表征分析及定量而言，并没有什么差异。但如果作为药物和靶点作用机理的研究，需要结合多种分析手段进行验证。

Q：EAD 片段化为了解蛋白质如何进行翻译后修饰带来了新的能力，这是生物标记物研究中一个重要但具有挑战性的领域。请您详细介绍EAD片段化是如何做到精确检测和定量蛋白质糖基化模式并区分异构氨基酸的？

EAD的全称是Electron Activated Dissociation，电子活化裂解，这种碎裂技术可以产生c/z离子用于生物制品的表征分析。传统的CID碰撞诱导解离，在碰撞气体作用下打断肽键产生b/y离子的同时，往往把一些翻译后修饰信息，比如糖基化、磷酸化等，都从肽段骨架上打碎了，这样我们在进行修饰类型和位点鉴定时很有难度，而EAD碎裂模式，利用电子精准切割产生c/z离子，保留糖基化等修饰信息完整连接在肽段上，极大的降低了翻译后修饰鉴定的难度。另外一些常见的异构化氨基酸，比如脱酰胺化，亮氨酸和异亮氨酸，是生物制品表征分析不可避免的问题。传统意义的CID碎裂，由于母离子、子离子分子量完全一致，即使仪器拥有百万以上的分辨率，也无法将天冬氨酸和异天冬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸区分开来。而EAD碎裂，异天冬氨酸的特征碎片c+57和z-57，是天冬氨酸不具备的，亮氨酸具备特征碎片z-43，异亮氨酸具备特征碎片z-29，这些都是CID碎裂无法区分的。SCIEX今年发布的ZenoTOF 7600系统，具备EAD和CID两种互补的碎裂模式，可以提供丰富的碎片离子信息，用于复杂生物制品的深度表征。

SCIEX中国生物制药市场开发经理 唐恺即将出席9月23-24日在苏州举办的NID 2021核酸药物产业发展论坛，并在现场分享个人的经验与见解。

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