Simple Nano-Luciferase-Based Assay for the Rapid and High-Throughput Detection of SARS-CoV-2 3C-Like ProteaseAnalytical Chemistry ( IF 8.008 ) DOI: 10.1021/acs.analchem.2c02590在本研究中，描述了一种易于操作的纳米荧光素酶(nLuc)传感器，用于快速检测SARS-CoV-2编码的3-凝乳胰蛋白酶样蛋白酶(3CLpro)。该技术基于3CLpro对重组体nluc的裂解反应。基于nLuc的检测是一种通用的一步法，在检测中自然具有特异性。稳定性、灵敏度、检测范围和响应时间都得到了充分的表征。在人工唾液和人唾液3CLpro检测以及抗病毒药物筛选中的应用表明，该方法可以一步定量3CLpro，具有较高的灵敏度。基于nLuc的检测方法具有独特的特点，可在辅助诊断SARS-CoV-2以及其他类型的冠状病毒感染中获得广泛应用。
图1。本方法检测3CLpro的原理。(A) MBs-peptide-nLuc加入到含有3CLpro标准物(或病毒裂解液)的PBS中。(B)用3CLpro裂解MBs-peptide-nLuc表面的肽，将nLuc释放到上清液中。(C)将上清转移到预先添加了荧光素酶底物的96孔板中，(D)使用微孔阅读器检测每个孔的信号。
2019年底爆发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的。新冠肺炎以上、下急性呼吸道感染为主，症状轻则轻，重则致命。截至目前，新冠肺炎疫情仍在全球影响5.3亿多人，造成至少数百万人死亡。COVID-19是一种传染性极强的疾病，是一场日益严重的全球公共卫生危机。值得注意的是，疫苗接种是减少COVID-19影响的有效机制，但接种COVID-19疫苗的人群仍然存在感染SARS-CoV-2变种的风险。目前，COVID-19的治疗主要以缓解症状为主，尚无特定的治疗方案。快速、高通量诊断新型冠状病毒对疫情防控具有重要意义。目前，新型冠状病毒的检测技术主要包括分子诊断技术和免疫诊断技术。SARS-CoV-2 RNA在症状出现前即可检测到，实时荧光定量PCR (RT-qPCR)是诊断SARS-CoV-2的金标准，具有准确性高、检出限低的特点。然而，标准技术是劳动密集型的，需要昂贵的热循环仪器。这些资源在即时检测(POC)环境中是不可用的，这促使研究人员转向在单一温度下进行的等温扩增作为替代方案。横向流动生物传感器是一种操作简单的POC免疫诊断技术，可在15分钟内肉眼观察到结果，但其灵敏度低限制了其在SARS-CoV-2早期筛查中的进一步应用。最近，各种新技术，如用于核衣壳蛋白和抗体检测的微流控芯片，用于S蛋白检测的(11−13)液体比色法和电化学方法，用于病毒蛋白酶3-凝乳蛋白酶样蛋白酶(3CLpro)检测的比色棉签检测，也被报道用于SARS-CoV-2检测。病毒编码的蛋白酶在病毒复制中起着至关重要的作用，包括HIV蛋白酶、HCV的NS3蛋白酶、SARS-CoV-2的3CLpro。3CLpro也称为主蛋白酶，作为二聚体具有活性，是SARS-CoV-2复制过程中的关键蛋白酶。3CLpro负责处理病毒多蛋白(pp1a和pp1b)，并产生感染期间病毒RNA复制所需的各种功能蛋白(如聚合酶和解旋酶)。SARS-CoV-2中3CLpro具有高度保守性，其突变通常导致失活。因此，3CLpro不仅是抗SARS-CoV-2药物开发的一个有吸引力的靶点，也是SARS-CoV-2检测的一个有吸引力的靶点。蛋白酶选择性地靶向并在特定位点切割肽键，这已在各种方法中得到报道，如比色测定法、电化学测定法、荧光传感器、表面增强拉曼散射测定法、表面等离子体共振测定法和基于液晶的测定法。这些方法大多耗时费力或成本较高，难以满足快速、高通量检测新冠病毒的需求。Dutta等人于2022年开发了一种用于3CLpro检测的新型比色棉签。这是一种精密、便携的检测方法。然而，棉签上化学预吸收剂缺乏安全性评价，敏感性较低，限制了其在SARS-CoV-2早期筛查中的进一步应用。纳米荧光素酶(nLuc)是一种非atp依赖性生物发光酶。nLuc的发光信号比传统的Firefly和Renilla荧光素酶要亮150倍左右。nLuc发光信号的半衰期约为30 min ~ 2 h，具有较高的灵敏度和超高的稳定性，是一种很有前途的分子诊断报告材料。本文开发了一种基于nLuc的快速高通量检测SARS-CoV-2 3CLpro的简单方法，并对该传感器在抗病毒药物筛选中的应用进行了测试。遇见MEET YOU等你很久啦！
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