核酸提取—RNA
在分子生物学研究中，有很多实验需要获得目的基因的序列进而确定基因的表达水平，这就需要得到样品中高质量、高纯度的RNA，本文就RNA提取的原理、方法和注意事项进行总结，并提供了不同类型样品RNA提取的推荐试剂盒。
RNA提取的基本原理
裂解过程
高浓度蛋白质变性剂的裂解方法，是抽提RNA的首选方案。
总RNA的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，而在DNA提取过程中存在的基因组与蛋白质“缠”住的问题，并不会对后续的纯化过程产生大的影响，可以不考虑。
高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的RNA酶，从而保证了RNA的完整性，绝大部分样品的RNA抽提方法，都是以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。
Trizol方法
最常用的RNA提取方法是Trizol方法。Trizol内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸，由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离，取出水相后，通过有机溶剂 (氯仿) 抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。
Trizol方法的提取过程：
取离心管做好标记，将一定量的待提取样品应用液氮研磨成粉末状；
加入1mL的Trizol，漩涡混匀，室温静置5min。
一定要将材料研磨充分，且一旦研磨完毕立刻加入Trizol混匀；
加入200µL氯仿，上下颠倒15s，室温静置3min；
12000 r/min 4℃离心15min；
新取一离心管，小心吸取无色上清至该离心管；
样品分三层 (无色上清水相，中间白色层，粉色下层有机相)；
6. 加入等体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴10～20min，弃上清；
7. 用1mL 75%的乙醇悬浮沉淀，12000 r/min 4℃离心10min；
8. 弃上清，再短暂离心，沉淀于室温下晾干；
9. 加入30-50µL DEPC处理的水溶解RNA。
注：使用一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。
RNA提取注意事项
样品的采集和保存
以RNA提取为目的的样品，在采样时就要根据RNA提取的实验设计进行分装，在RNAlater中保存 (推荐QIAGEN生产的)，4℃运输并过夜，以保证RNAlater充分与样品细胞结合，从而完成RNA的固定，之后转入-20℃保存，如需长期保存 (几个月以上)，应当在-80℃下保存。
提取过程中的注意事项
所有实验所用的枪头、离心管等消耗品均要使用RNase-free的；
整个过程要在无RNase污染的条件下进行，通常可以在无菌操作台中进行实验，并用75%的酒精进行擦拭杀菌，如有必要也可在实验前喷洒一些商用的RNase抑制剂；
所有相关溶液的配制要使用RNase-free水或DEPC水 (包括75%酒精也需要用无水乙醇与DEPC水配制)；
溶液的配制使用移液器进行操作，切勿使用量筒等中间器皿；
研钵、研棒、镊子、剪刀等用锡箔纸包好后，200℃干热灭菌4h；
实验过程中一定要戴手套和口罩；
异丙醇、氯仿、乙醇等试剂要使用未开封的，或者开封之后直接分装至小容量离心管的，以避免多次使用的交叉污染；
注1：现在一般实验室都使用从公司直接购买的RNase-free水，这种水通常都是大包装，比如100mL一瓶，在第一次使用的时候，开盖后一定要将其分装到1.5或2mL RNase-free离心管中，在冰箱中保存，每次实验用多少取多少，避免多次实验的交叉污染。
注2：一定要戴口罩！！！不要怕麻烦，因为你真没法保证实验过程中不打喷嚏！！！
不同类型样品RNA提取试剂盒推荐
| 样品类型 | 推荐试剂盒 |
|---|---|
| 血液 | QIAamp RNA Blood Mini Kit (QIAGEN) PAXgene Blood miRNA Kit (QIAGEN) RNeasy Protect Animal Blood System (QIAGEN) |
| FFPE | RNeasy FFPE Kit (QIAGEN) |
| Cell free样本 | GenElute Plasma/Serum RNA Purification Mini Kit (SIGMA) miRNeasy Serum/Plasma Kit (QIAGEN) |
| 海洋动物组织 | 动物组织总RNA提取试剂盒 (TIANGEN) |
| 细菌 | RNAprotect Bacteria Reagent (QIAGEN) RiboPure-Bacteria Kit (Ambion) |
| 水体 | RNAqueous Mini Kit (Ambion) mirVana RNA Isolation Kit (Ambion) SV Total RNA Isolation Kit (Promega) |
| 土壤 | PowerSoil RNA Extraction Kit (MoBio) RNAqueous Mini Kit (Ambion) |
| 粪便 | PowerSoil RNA Extraction Kit (MoBio) |
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