科研思路｜JP：蛋白质组揭示仿刺参与繁殖有关的体液免疫和生理特性的性别差异
论文信息
论文题目：Proteomics reveals the gender differences in humoral immunity and physiological characteristics associated with reproduction in the sea cucumber Apostichopus japonicus
期刊：Journal of Proteomics
IF：3.537
发表时间：2020
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本文通过对繁殖前后不同性别仿刺参体腔液的蛋白质组学分析，比较了与性别和繁殖过程相关的仿刺参体液免疫系统和生理特性之间的差异，最终发现：
性别和繁殖过程均是影响仿刺参体腔液蛋白质组成和表达的重要因素；
繁殖过程会显著降低仿刺参体液免疫系统中补体系统的活性；
繁殖过程会增强雌性但是降低雄性仿刺参的体液免疫能力；
在繁殖过程结束之后，雌性仿刺参的肌肉收缩及移动能力增强；
在繁殖过程结束之后，雄性仿刺参会加大营养物质的吸收和消耗，进入快速生长阶段。
该论文是本人实验室在本月刚刚发表的一项研究成果，与之前一篇发表在《Fish and Shellfish Immunology》的转录组文章属于一个相同的项目，所用样本是一致的，只是之前的转录组研究是针对体腔细胞分析细胞免疫系统，而本次的蛋白质组研究是针对没有细胞的体腔液，分析的是体液免疫系统(没有细胞就没有转录本，只能用蛋白质组进行研究)。
本文发表在《Journal of Proteomics》上，在蛋白质组学专业领域，该杂志虽然不是最顶级的期刊，但是也属于排名比较靠前的了。不过我个人觉得这个杂志相对比较好投，目前本人已经在该杂志发表了两篇文章，另一篇文章的解读在这里，其实两篇文章涉及的内容和研究思路都不是很难做，不过这个杂志今年升为1区了，以后对文章的要求没准会提高！
研究背景
由于其极高的营养价值和药用价值，仿刺参的养殖产业在我国快速发展，仿刺参需求量的增加对于其养殖效率提出了更高的要求。生物的生理性状受到多种因素的影响，其中性别是一个十分重要的因素，在多种动物中，均发现了由性别所造成的生理性状的差异。因此，研究不同性别仿刺参生理性状的差异及其分子机制对于提高仿刺参养殖效率具有重要意义。
仿刺参依赖于先天性免疫系统抵抗外界外界压力和致病菌的侵染，其免疫系统主要可以分为依赖于体腔细胞的细胞免疫系统和依赖于体腔液的体液免疫系统。虽然体腔细胞已经被证明是仿刺参先天性免疫系统中最重要的也是免疫能力最强的器官，但是其流动的体腔液及其中所含的胞外物质所形成的体液免疫系统同样也不可忽视。性别会影响生物的免疫能力，比如通常来说，女性的免疫力被认为高于男性。因而，需要进一步的研究以获得仿刺参体腔液上清免疫免疫能力更为全面的性别的差异。
有性繁殖是动物中普遍存在的生态过程，在高等动物中，体液循环系统负责在机体内传递信号分子，其不仅能够传递外源环境变化诱导的响应信号，同时也能够传递自身生理过程，如繁殖等所产生的需求信号。仿刺参具有一个典型的开放循环系统，其充满了可流动的体腔液，类似于高等动物的体液循环系统，但其在仿刺参繁殖过程中所扮演的角色还并不清楚。
技术路线
本研究的过程及其非常简单，就是挑选繁殖前后不同性别的仿刺参，收集其体腔液，经过离心去除体腔细胞，然后进行蛋白质组学分析。
数据分析的思路如下：
PLS-DA和PERMANOVA确定不同样本见蛋白质表达谱的整体差异；
差异表达蛋白的识别；
手动挑选免疫相关的差异表达蛋白分析其表达变化规律；
差异表达蛋白富集分析识别受影响的关键功能；
关键功能相关差异表达蛋白作用机制推导；
iPath识别差异的代谢路径。
研究结果
1、蛋白质表达差异识别
利用所有鉴定到蛋白质的表达水平进行PLS-DA分析，展示不同组样本的聚类模式，发现不同性别和不同繁殖阶段的仿刺参体腔液上清分别聚类，进一步使用PERMANOVA比较其差异显著性，结果表明，性别和繁殖过程均会显著改变仿刺参体腔液上清中的蛋白质组成和表达水平。
因为本次研究涉及4个不同的样本组，分别是繁殖前磁性 (BF)、繁殖前雄性 (BM)、繁殖后磁性 (AF) 和繁殖后雄性 (AM)，因而分别进行了4组不同的比较以鉴定同性别不同繁殖时期 (BM-VS-AM和BF-VS-AF) 以及不同性别同繁殖时期 (BM-VS-BF和AM-VS-AF) 的差异表达蛋白。结果发现，同性别不同繁殖时期的差异表达蛋白数目要高于不同性别同繁殖时期，此外，在同性别不同繁殖时期的比较中，上调和下调表达蛋白的数目基本类似，而在不同性别同繁殖时期的比较中，上调蛋白的数目要高于下调蛋白。
2、体液免疫能力差异分析
通过手动筛选，在鉴定到的差异表达蛋白中挑选出与免疫活性相关的蛋白，之后使用热图展示其在不同比较组中的表达变化水平，得到如下结果：
无论是雄性还是雌性，在繁殖前其补体系统 (Factor B、Factor H、C3-2、C3) 的活性均高于繁殖后。
在雄性仿刺参中，繁殖过程会导致SOD、CTSD、Oncoprotein和Lectin表达的下降，而在雌性仿刺参中，繁殖过程会导致Oncoprotein、Lectin、Muc2、HSP96、14-3-3和 zeta表达的上升，说明不同性别仿刺参繁殖的过程多数免疫相关蛋白的表达水平变化并不一致。
无论繁殖前后，雄性中补体受体蛋白1（CR1L）和巨噬细胞甘露糖受体蛋白1（MRC1）的表达较高，而雌性中补体C3-2的表达较高，其可以作为鉴定性别的潜在靶标。
在繁殖前，HSP96、Oncoprotein和14-3-3 zeta在雄性中表达水平较高，而在繁殖后，这3个蛋白在雌性中表达水平较高，说明繁殖过程对不同性别仿刺参这3个蛋白相关的功能影响很大，这些免疫因子在繁殖后雌性中表达水平较高与转录组中发现的雌性仿刺参杀菌能力较强的结果相一致。
在繁殖前，CTSD在雌性仿刺参中高表达，其会激活多种免疫因子和抗菌肽，这与转录组中发现的雌性仿刺参杀菌能力较强的结果相一致。
3、关键功能识别
首先通过对差异表达蛋白的富集分析，识别可能受到性别和繁殖影响的关键功能。
与繁殖前相比，在繁殖后，无论是雄性还是雌性仿刺参中，沙门氏菌感染和MAPK信号路径均发生富集，说明在繁殖后，仿刺参可能更易受到致病菌的感染，并且会利用MAPK信号路径传递其免疫信号发挥免疫功能。
与繁殖前相比，在繁殖后的雄性仿刺参中，黏着斑相关蛋白受到富集，说明在繁殖后的雄性中，细胞之间的粘附和组织分化加强；同时，胰腺分泌和肾素分泌相关蛋白同样受到富集，说明此时的仿刺参对于食物的消化能力和能量的吸收需消化增加；与雌性仿刺参相比，在繁殖后的雄性仿刺参中，黏着斑、胞外基质-受体相互作用和唾液分泌路径相关蛋白受到富集，表明在繁殖后，雄性比雌性可能具有更快的生长速度和更高的能量需求；此外，这些结果表明，此时雄性仿刺参可能进入了快速生长阶段。
与繁殖前相比，在繁殖后的雌性中，紧密连接相关蛋白受到富集，同时心肌收缩和癌症中的蛋白聚糖相关蛋白受到富集，说明此时仿刺参的体腔夜体积和体腔压力此时受到调控，并且细胞分化能力增加。
4、功能变化机制推导
与繁殖前相比，在繁殖后的雌性仿刺参中，RAC1蛋白表达大量上调，其调控ARP2/3复合体的形成；同时，cortactin的表达水平同样显著上调，其辅助ARP2/3介导的G-actin核化形成F-actin的过程；F-actin在上调表达的filamin的作用下形成网状的actin cytoskeleton，网状的actin filaments在上调表达的tropomyosin的调控下与myosin结合，从而加强肌肉收缩的能力，并促进基于actin的移动；以上结果表明，雌性仿刺参在产卵后会具有更强的肌肉收缩和移动能力。
与繁殖前相比，繁殖后的雄性仿刺参富集的差异路径中，主要涉及的差异表达蛋白是CLCA1、Tenascin和整合素β；而在繁殖后，雄性与雌性仿刺参相比富集的差异路径中，主要涉及的差异表达蛋白是DMBT1、Tenascin和整合素；CLCA1由钙离子激活，诱导细胞内氯离子的外排，从而激活碳水化合物、蛋白质、脂肪和维生素的消化和吸收；DMBT1在上皮细胞分化的过程中发挥重要作用；Tenascin可以去除细胞黏附的过程，并且与整合素结合促进上皮细胞生长因子的表达，促进细胞的分化和组织形成；以上结果表明，雄性仿刺参在繁殖后可能会加大营养物质的吸收和消耗进入快速生长阶段。
5、生理代谢差异分析
将识别到的差异表达蛋白的KEGG注释信息导入iPath 3.0工具，以识别不同组样本中具有明显差异的生理代谢路径，结果发现通过消耗糖类合成精氨酸的路径在雄性仿刺参体腔液中明显上调表达，而在雌性仿刺参中，嘌呤代谢发生明显上调。