【文献解读】如何从FFPE样本中提取高质量的DNA或RNA？

文章概览

论文标题：Reliability and performance of commercial RNA and DNA extraction kits for FFPE tissue cores

发表日期：2017年6月

研究目的：从FFPE样本中获取足量的高质量DNA或RNA

提取试剂盒：14个试剂盒，包含16种提取DNA和RNA的方法

检测方法：荧光法、分光光度法、NanoString nCountergene expression assays、reverse-transcriptase real-time PCR for RNA、methylation-specific PCR assays for DNA

研究目的

从FFPE样本中获取足量的高质量DNA或RNA。

FFPE样本DNA的复杂性

1.会与蛋白质和其他细胞成分交联；

2.随着时间的推移可导致福尔马林氧化成甲酸，从而引起碱基脱嘌呤和核酸链断裂；

3.可能受到PCR抑制剂的污染。

研究方法

实验样本的选取

选择肿瘤细胞丰富的区域，用手动打孔机钻取组织样本，用数码相机拍照，然后用ImageJ软件测量出组织体积。

提取试剂盒的选择

一共14个试剂盒，包含了16种提取DNA和RNA的方法，其中RecAll和AllPrep既可以提取RNA又可以提取DNA。

核酸的提取及定量

样本前处理：从4块归档的FFPE组织石蜡块中钻取了120个样，共计37.2mm³。用二甲苯室温脱蜡5分钟两次，无水乙醇室温复水5分钟两次，然后使用匀浆机匀浆。  

核酸提取：每份样本0.68mm³,按照各个试剂盒说明书提取，每个试剂盒三重复。其中RecAll和AllPrep试剂盒提取时，在匀浆后的组织中添加蛋白酶K，然后取上清提取RNA，沉淀提取DNA。

核酸产量及纯度检测：使用dsDNA HS和RNA BR在Qubit3.0上分别对DNA及RNA定量；使用分光光度计测定A260/280和A260/230判定DNA及RNA纯度。

研究发现

1.PCR抑制剂检测

使用大鼠11-β-羟基类固醇脱氢酶1基因和PowerUpSYBR Green Master Mix建立qPCR体系，添加2μl提取后的DNA或RNA，检测对PCR反应体系的抑制。

单因素方差分析结果显示，8个RNA提取试剂盒的Cq值和Control的Cq值基本在同一水平，表明RNA纯度较高；6个DNA提取试剂盒中有5个试剂盒的Cq值和Control的Cq值基本在同一水平，但AllPrep和对照组有明显差异。

2.PCR抑制剂补充实验

额外选取了前列腺癌和乳腺癌样本进行抑制实验，发现抑制只在前列腺癌中发生。前列腺癌样本DNA分别稀释十倍和二十倍再进行抑制实验，在稀释十倍时抑制情况有明显改观。考虑到实际应用时input的量，可以抑制PCR反应的杂质被充分稀释，从而不会影响PCR。

3.核酸片段大小的评估

方案1：使用RNA 6000 Pico 试剂盒在2100生物分析仪上检测，用大于200bp碱基对百分比（DV200*）表示。

*DV200值表示的是片段大于200bp的相对数量，而不是绝对数量，并不能用于反映进入PCR反应的核酸的性能。

方案2：评估RNA片段分布时先进行逆转录，然后用扩增子大小从92bp到386bp（大约以50bp大小递增）的6对碱基对和cDNA进行PCR扩增；评估DNA片段分布时用扩增子大小从102bp到300bp（大约以65bp大小递增）的4对碱基对和DNA进行PCR扩增；扩增后产物用3%凝胶电泳质检。

4.NanoString mRNA 检测

取100ngRNA用48种探针杂交，然后在nCounter™ DigitalAnalyzer中分析。

5.实时荧光定量法对mRNA分析

先把RNA逆转录，然后用TaqMan-based RT-qPCR gene-expression assay kits对PGK1, KRT8, HPRT1三个管家基因的表达量进行实时荧光定量。

AllPrep的Cq值相较于其他三个试剂盒有所升高（扩增减少），原因是对PCR有抑制。

6.甲基化特异性PCR检测DNA

先将100ng基因组DNA用亚硫酸氢钠把未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后用NEB的EpiMark bisulfite conversion kit过柱纯化。取2μL纯化后DNA样本进行甲基化特异性PCR，检测前列腺癌中已知的三个容易甲基化的基因（GSTP1、ABCB1、RASSF1），此外还添加了Alu重复元素做为阳性对照。

AllPrep、DNeasy、GenJet三个试剂盒的甲基化程度一致，RecAll和QIAamp两个试剂盒提取的DNA影响到了真实的甲基化情况。

7.AllPrep提取方案重现性

从12个前列腺癌FFPE石蜡块中用0.6mm钻孔器钻取了9个样本，样本处理匀浆后平均分配给3个实验室进行提取。

AllPrep试剂盒在产量、质量、下游应用的兼容性上相关性好，AllPrep提取方案最佳。

8.样本保存年份对回收率的影响

AllPrep试剂盒实验室间研究时未发现年份与产量之间的相关性。

参考文献

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VariantBaits™ Target Enrichment System

液相杂交捕获系统

基于自主知识产权μParaflo® 微流体芯片平台合成RNA捕获探针，采用液相杂交技术捕获靶标DNA，使用生物素标记探针诱饵，探针序列与靶向序列互补，完成靶向序列文库的富集与制备。可用于从小到大规模的基因捕获，容忍某些局部模板的变异。

VariantPro™ One-Step Multiplex PCR System

一步式多重PCR建库系统

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基于自主知识产权的VariantPro^TM一步式多重PCR建库系统和VariantBaits^TM液相杂交捕获系统，联川生物致力于为企业级客户提供更精确快捷的定制化产品与服务，已为国内上百家知名基因检测公司及医学检验所提供精准医学检测产品。 

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