首次发现病毒编码的朊病毒丨我们终究是幸运的，终于活着看见了今天的朝霞——许晓东博士的心路历程

责编丨寥汀

“这项成果的背后有着很多鲜为人知的曲折故事。文章如何从投Science到最终发表到NC？一个科研管理工作者如何重新回到学术界？”

图片引自：http://www.trackingzebra.com

朊病毒（prion）是一类具有感染性的特殊蛋白，这种蛋白能将某种构象在同种蛋白甚至异种蛋白间传递，最终导致所有蛋白都发生变构【1】。20世纪80年代科学家们在研究传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathy, TSE）时发现了朊病毒的存在，美国生化学家Stanley Prusiner因发现朊病毒获得了1997年诺贝尔生理学或医学奖（下图）。

1997年诺贝尔医学和生理学奖得主Stanley Prusiner。图片引自：https://www.nobelprize.org

近40年来，科学家们陆续在动物、植物、真菌和细菌中发现了朊病毒【2-4】。但是，作为自然界中数量巨大、种类繁多的生命形式，病毒中是否存在朊病毒一直不为人所知。

1月21日，西北农林科技大学生命科学学院许晓东课题组在Nature Communications杂志在线发表了题为A viral expression factor behaves as a prion的研究论文，报道了第一个由病毒编码的朊病毒，具有重要的创新意义。

许晓东副教授在研究杆状病毒表达因子LEF-10时发现，该蛋白具有不同寻常的聚集行为，这种现象与朊病毒十分类似。在酵母鉴定系统中，LEF-10表现出了典型的朊病毒特征。而在病毒感染的昆虫细胞中，高表达的LEF-10可以从可溶态转变成聚集态，进而调控病毒的增殖。这些结果表明，LEF-10是一个病毒编码的朊病毒。该发现解释了生物制品工业的一个困惑，即接种杆状病毒的数量与外源蛋白产量缺乏相关性。另外，人们很早就发现疱疹病毒感染与阿尔兹海默病具有某种联系；既然病毒可以编码朊病毒，那么这种联系的中间环节很可能是疱疹病毒编码的朊病毒；这或许为老年痴呆病的防治带来一线曙光。

2016届硕士研究生南昊为该论文第一作者，许晓东副教授为通讯作者，陈红英教授和英国肯特大学Mick Tuite教授为共同作者。

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《病毒编码的朊病毒》

文丨许晓东 博士

“此时此刻，我账面上剩余的经费不足千元。只能说，对于我们这样的小课题组，原始创新的风险是巨大的。这条路很大的可能是越走越窄，以至于最终面临没有经费没有研究生的窘境。然而，我们终究是幸运的，终于活着看见了今天的朝霞。”

持续很多年的研究终于隐约看见了终点，趁着投稿期间空挡，陆续把这段历史整理出来。

2001年11月到了英国雷丁大学Ian Jones教授实验室后，第一个项目就是表达5个杆状病毒晚期因子。因为这类蛋白可能有活性，所以在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达量可能会有所不同。为了检测蛋白的产量，就要做Western blot。做这个工作，转膜时一般都把浓缩胶剥离扔掉。因为我以前没做过，就把整块胶都转了。压了X光片后发现，LEF-10泳道浓缩胶位置有很强的杂交信号。当时觉得可能是样品没有煮好，但重复了几次还是这样——这引起了我的兴趣，因为在我有限的阅历里没见过这个现象。那一段时间我经常到图书馆查生化方面的书和期刊，看看这是不是一个未被发现的现象，但一无所获。

因为老板的HIV项目下来了，他把我转到新项目，原来表达那几个蛋白的工作告一段落。老板把这部分工作写了一篇文章，连续被几个杂志拒了之后，2004年发表在Virus Genes上【5】。虽然这个工作已然结束，但浓缩胶那个事一直萦绕在心头，挥之不去。为什么呢？这就要扯远一点了。当年读研的时候做的很不顺利，硕士毕业后坚决去了中科院微生物所科技处，从事科研管理工作。那份工作很清闲，闲来无事就学网络和Linux，再无聊的时候就读各类项目的申请书什么的。因为我已经跳出了具体的研究领域，所以我更能从一个前所未有的高度去审视这些课题。读的多了我就发现，一个好的课题——也许做的时候仅仅着眼于局部——必须立意高远，必须有生物学上的普遍意义。正是这个背景，导致我在看到了浓缩胶中的信号后，立刻觉得这个现象很可能具有某种潜在的意义。

此后我一直断断续续地做一些lef-10相关的工作，想看看浓缩胶里到底是什么玩意。通过镍柱洗脱曲线，我判断这个“复合物”不均一。纯化后的“复合物”可以超离心离下来，推测分子量非常大，已经不是真溶液了。离心下来的东西重悬之后用苯酚氯仿抽提，能从里面提出DNA和RNA。然后这个实验就进行不下去了——因为不知道在不花钱的前提下还能做些什么，只好往功能上做，看看lef-10有什么生理功能。正好实验室有RedET敲除系统，把lef-10敲除之后无法重组出病毒，奇怪的是用lef-10也拯救不回来。后来隐隐地觉得哪里不对，仔细检查序列，才发现lef-10和必需基因VP1054重叠，敲除lef-10时把VP1054也给敲除了，乌龙了。这些结果2006年2月在组会上讲了一次，当时老板也没表示什么特别的兴趣，加之不知道如何在不影响VP1054的前提下敲除lef-10，这件事就放下了。

2009年决定回国到西农工作，回国之前和老板说未来想做杆状病毒方面的工作，老板把全套杆状病毒的材料给了我们。当时我就想集中精力做做lef-10。刚回来那段时间我一有机会就问别人是否见过这种现象（其实当年在英国的时候也是这样逢人就问），问到的人都说没见过，这更加坚定了我做下去的决心。之后的进展异常缓慢，在英国做过的很多实验都重复不出来。2011年10月我在组会上把之前所有的关于lef-10支离破碎的工作总结了一遍。当时还和prion比较了，觉得它们的差异蛮大的（Sup35和Aβ-42虽然号称抗SDS，但不能加热水煮，而lef-10在SDS中即便煮10分钟也不解离）。最后我在PPT中提到未来要做的工作：1、确定是complex还是polymer；2、找到与此相关的模体（motif）；3、在其他的杆状病毒中lef-10是否也有这种现象；4、Lef-10的生理功能是什么，这种现象与其生理功能是否有相关性。

由于“复合物”的难解离特性，当时推测可能是共价交联，于是让赵钰把可能参与交联的氨基酸残基都突变了，但结果充斥着矛盾，似乎说明“复合物”与共价交联无关。其中截短突变LEF-10（27-78）能形成阶梯状条带，我觉得形成这个阶梯应该与形成“复合物”的机制是一致的，就让当时在实验室做本科毕业论文的南昊纯化了LEF-10（27-78），送出去打了个分子量质谱。结果是，这些阶梯的分子量是严格的倍数关系，证实了“复合物”不是交联的推测。这个结果非常重要，它直接导致了我们把后续的研究转到蛋白质聚集上来。当时南昊的另一部分工作是做蓝耳病病毒几个蛋白的酵母双杂，2013年5月写本科毕业论文时他问我写哪个，我说就写质谱，后来他觉得工作量太小就没写。很久以后他才理解这个实验的意义有多大。

因为找到了蛋白质聚集这个正确方向，未来的研究就不会太盲目了。之后就是安排赵钰在细菌中做一个诱导聚集的实验，结果很好，支持了当时的一个直觉——LEF-10可能是个类似prion的蛋白。2013年整个暑假我都在平台上用荧光显微镜一遍一遍地找昆虫细胞中LEF-10的聚集状态（最初的目的是看LEF-10在细胞中的定位）。得力于leica正置荧光显微镜超强的激发光源，原生启动子表达的lef-10-GFP可以在光漂白之前很短的时间内被观察到。连续看了几天的镜子，眼珠子都快爆出来了，突然某一天看到视野里一个细胞中密布着针尖一样大小的荧光，与大量的发着暗淡绿色荧光的细胞不同，这些小的荧光点衬托在完全漆黑的背景上。因为之前不知道生理状态下的聚集是啥样的，所以很难发现这样的细胞。一旦抓到第一个这样的细胞后，再找就不难了。这些细胞都有一个共同特点，就是背景漆黑。当时我脑袋里迅速出现一个词——prion，因为只有prion才能使所有可溶的构象全部变成聚集的。我马上设计了一个用流式细胞仪研究细胞裂解液中诱导聚集的实验，不幸的是失败了。不管怎么说，观察到的细胞中的聚集加上赵钰的细菌诱导实验，我已经非常确信prion这个推测了。

2013年10月9日我在组会上把之前所有的结果讲了一遍。对照酵母中prion的鉴定标准，我们目前面临着巨大的技术障碍：聚集倾向太严重、没有表型、可能需要一套酵母鉴定系统等。但是我也为这个研究勾画了美好的前景：“证实LEF-10是prion能为‘prion广泛存在假说’提供更多实例。目前prion只在动物和真菌中被鉴定，我们的工作可以把这个范围扩展到病毒。从更广泛的生物学意义上来说，如果prion是广泛存在的，那么获得性遗传也可以存在。”

之后我就开始看酵母prion的文献，这个领域实在是太陌生，以至于很长时间都没有什么切实可行的实验策略。2014年5月份，蒋向从北大回来，准备本科毕业答辩。他组会的时候讲了一篇酵母prion的文献（Cell 2009,137:146-158）【6】，听的过程中我忽然觉得我们需要的就是这样一个酵母鉴定系统。当时我就说，这个系统对于我们太重要了，一定要把它要来，要不来的话也要想办法派个人去美国做。紧接着，6月20日组会上我讲了prion发现以来的进展，最后把prion的核心特征总结为：1、能以两种稳定的状态存在；2、一种状态可以转换成另一种状态（自发/诱导）；3、在某种情况下，后一种状态可以“治愈”；4、存在状态可遗传。并且明确提出，酵母系统对于我们来讲是一块敲门砖，是让科学界承认LEF-10是prion的必由之路。

2014年7月份我给美国的Randal Halfmann（上面提到的那篇Cell的作者之一）写信要酵母系统，他很快就回信答应给我们，但需要我们提供FedEx账号。折腾了一圈，再写信他就不回了，直到12月份他回信说清理垃圾邮件的时候发现了我的回信，问我还要不要酵母。因为与Randal的联系中断，只好求助于英国肯特大学的Mick Tuite。当时陈红英正在英国，她联系上了Mick，Mick答应把酵母和质粒邮到中国。2014年10月份酵母和质粒寄到了，当时我没想好让谁做，因为酵母实验涉及极其复杂绕脑的遗传学知识。还没等我仔细考虑，南昊就主动接手了这个工作。虽然Randal和Mick都提到了这套系统tricky，当时我们谁都没太在意，事实上后续的实验确实面临很大的挑战。直到2016年南昊硕士毕业，他都一直在折腾这套系统，但不管怎么说，这时已经确认lef-10在酵母里确实表现出prion特征。2016年南昊写毕业论文时纠结是把lef-10定为prion还是prion-like，答辩的时候周恩民建议我们还是写成prion-like。他的建议是对的，这里确实缺少几个关键的实验证据。这段时间周新宇做了一些lef-10聚集与功能之间关系的实验，加上以前做的林林总总（不包括酵母的工作和细菌中诱导的结果），2016年春天发到了Plos ONE上【7】，为的是学生能硕士毕业——这个结果发的还是很心疼的，后面会说。

因为酵母系统太麻烦，加之我也没了后续的研究生，南昊毕业之后很难找人继续把酵母的工作做下去，所以我在2016年暑期前设计了一个基于大肠杆菌的prion鉴定系统。南昊初步试了是工作的，于是他放弃了毕业后的工作，整个暑假都在验证这个系统，但不知道为啥，这套系统突然就不工作了，导致南昊很是郁闷。或许为了补偿这个失败，南昊决定留在实验室把lef-10做完。2017年一月份，突然Science上发了一篇发现第一个细菌prion的文章【3】，这让我们异常兴奋，毕竟这是酵母圈子之外的人发现的非酵母prion（2016年5月份发现植物prion是酵母圈子里的人做的）。这篇文章也让南昊和我有了紧迫感，这么短的时间内prion就拓展到了植物和细菌，很难说没有人盯着病毒。从这时开始我们才真真正正按照一篇文章的要求去补充实验。我和南昊讨论了很多次，最后把SDD-AGE和治愈作为必需的数据。后来我们俩扯了很长时间的皮，南昊希望我写出个文章的框架，他好往里填图；而我希望他把图做出来，我才能根据图写文章。不管怎么说，7月份文章已经有了点影子，南昊、我和陈红英也逐步捋清了文章中需要放的内容了。按照Nature和Science短文的格式写，只有4幅图的空间，文字也要控制在2000字以内，很是难写。我和南昊确定的4幅图分别是：1、故事的引子——聚集与否影响晚期基因表达；2、酵母系统鉴定lef-10 prion特征；3、鉴定prion结构域；4、细菌中的诱导实验。这里有个严重的缺陷，就是缺少在原生系统中prion特性的结果，因为这部分数据已经在Plos ONE上发了。要是没有这部分工作，这篇文章的水平会大打折扣，太闹心了。

时间往回拉一点，2017年5月9日，lef-10 cPrD（prion结构域）十个点突变在病毒上的拯救结果出来了，其中L21点突变的结果很特殊——活性比野生型高很多，当时我就意识到这个突变可能是不聚集的，野生型是因为过表达聚集了，所以表现出的活性不高。于是南昊在忙完手头的其他工作后，开始做原生启动子的拯救实验，还构建了两个gp64启动子控制的lef-10用于做过表达诱导。我的预期是，在原生启动子控制下，突变型与野生型相比，活性一致或者低一些，一旦过表达诱导出prion状态后，突变体就会表现出高于野生型的活性。由于寄予了厚望，实验结果让我心里拔凉拔凉的，原生启动子（非常弱的启动子）表达的突变型的活性还是比野生型高。我早晨看完结果后就回到办公室发呆，之后在走廊看见南昊，他也是一脸沮丧。我在办公室琢磨了一上午，突然间豁然开朗——最大的可能是，实验中lef-10已经是过表达了，要想不过表达，只能通过降低感染复数来实现。南昊马上重新做实验，把病毒做系列稀释，从很低的滴度开始感染细胞。2017年9月8日下午4点在平台上跑了流式，回到办公室后立刻开始分析流式的数据，折线图很快就出来了，一切都和预期的一样。虽然折线图异常丑陋，我、陈红英和南昊三个人依然对着屏幕激动不已。我们憧憬着未来，聊科学，聊哲学，聊了很晚才回家。正式的结果是12日出来的，困扰了我们很长时间的原生系统功能部分终于有着落了。

因为prion影响功能的结果很好，加之篇幅限制，我们痛下决心把赵钰的细菌实验去掉了。其实这个实验设计的非常巧妙，Julian Hiscox（陈红英以前在英国的老板）曾经高度评价了这个结果。但是由于从方法到结果都比较烧脑，几句话很难说清楚，于是乎我们把图四换成了L21突变相关的几个实验结果（还有一个重要原因，就是细菌实验里的点突变和酵母中的不一样，结果很难解释）。至此，文章的框架终于定型了。

之后就是一遍一遍修改论文，因为论文本身就很短，我们几乎一个词一个词地讨论怎么写。为了等一个关键的SDD-AGE照片，直到11月初才定了初稿。然后分别送给几个同事帮着看看，他们（郁飞，赵天永，崔洪昌，沈锡辉，刘夏燕）都给出了很好的建议和意见。给我老板Ian Jones看了之后他觉得我们的工作很好，他没想到我们能把lef-10做到这个程度，之后还花了不少精力给改稿子。我们也把文章草稿发给了肯特大学的Mick Tuite教授（就是前面提到提供酵母系统的），11月20日才收到Mick的回信（第一次发给他的e-mail他没收到。这里需要提醒大家，给老外发邮件，要避免任何汉字字符，老外的反垃圾邮件程序经常把汉字看成乱码），老先生提了很多绝对内行的意见——毕竟他是酵母prion领域元老级别的人物。我们逐条认真地给他写了回复。因为他提供了酵母和方法、还修正了很多关键的说法，我们邀请他作为文章的共同作者。Mick回信欣然同意了我们的提议，然后逐字逐句把文章修改了一遍。在论文造假猖獗的年代，Mick能同意成为从未谋面的研究组论文的共同作者，本身就是对我们结果重要性和可信性的肯定（BioArt注：最终发表在NC上的论文，许晓东为唯一通讯作者）。先前赵天永看了我们的SDD-AGE照片，坚决建议我们换掉，因为杂交的结果太丑了。事实上，Mick的酵母有别于美国的系统，它用的是sup35原生启动子，表达量低得可怜，这么丑的照片也要花费一到几个月的时间才能拿到。也许就是因为丑，Mick才认为这个结果是真实可信的。

2017年12月5日收到Mick的修改稿后，当天我们就把文章改好，下午就在Science网站上提交了。此前南昊查了所有编辑的背景，我们选择Stella M. Hurtley博士作为编辑。 Stella具有蛋白质折叠的研究背景，以前Science发表的prion相关的文章都是她编辑的，包括年初细菌的那篇文章。投稿系统显示稿件6日到编辑手中了（状态是Under evaluation），11日显示为To Advisor，这个状态一直持续到15日，然后又变回Under evaluation，然后很快就收到拒稿信。这个结果对我们是个小小的打击，毕竟1月份Science上发的细菌prion的文章是没有原生系统实验的，所以我们乐观地认为我们的论文至少能送审。

由于我情绪有些低落，之后就是南昊负责把论文投到Nature Microbiology和Nature Cell Biology，当然也都因为领域不适合被拒了。此时南昊还是很乐观，他乐观的情绪让我低落的心情渐渐平复。再往下投的话可以选择Nature Communications和PNAS，我和南昊讨论了很多次，最终决定投到NC，毕竟它的影响因子高于PNAS。

花了一段时间把短格式改成长文格式，2018年2月17日（正月初二）投稿。第一轮审稿很快，3月20日就回来了，审稿人1和3评价都很好，只有审稿人2提了很多基础病毒学的问题。之后我们花了很多时间补实验，一直到了8月9日才返回去。第二次审稿就没那么快了，写信问编辑，编辑说审稿人2联系不上，所以又找了一个审稿人，到了10月9日才收到审稿意见。此时只有审稿人1还有一个问题没解决，我们查了好多文献解释他的疑问，然后10月23日投回。到了11月23日收到了编辑原则上接收的邮件。

整个投稿过程持续了将近一年，从最开始的心潮澎湃到后来的波澜不惊。其实仔细想想，科研的最大乐趣在于搞清楚困扰你心头的疑惑，写文章是这个过程的终点，也是这个过程的副产物。其实，发文章不就是向科学界宣告自己的发现么？按道理发表在哪种级别的杂志都是无所谓的事情，但是名利世界，谁人又能坦然面对呢？

从去年准备投稿到现在，我给两届博士生做了生物学进展的报告。报告的结尾谈到这个研究的意义在哪里。我讲的是，把prion的存在延展到了生命的最后一个领域——病毒界。以前prion的特点之一就是胞质遗传，因为病毒没有细胞结构，所以不可能有什么胞质遗传。就是说，我们在把LEF-10装进prion这个篮子的时候，也在改变这个篮子的形状。另外，这个发现也能解决困扰杆状病毒表达领域多年的问题——高病毒滴度并不能有效地提高外源基因的产量。再有，这个发现有可能解释人疱疹病毒与老年痴呆之间的因果关系。

回头看看这些年走过的路程，虽然一直是磕磕绊绊的，但是终极目标从未变过。我们有成熟的敲除技术，杆状病毒也有很多未知功能的基因，随便做点什么都可以发个小文章，我竟然没有想过往这个方向走。由于研究的东西过于另类，一直申请不到课题。陈红英也不得已放弃了以前做的很好的蓝耳病病毒，被迫调整研究方向搞点经费，使我们实验室能在艰苦的条件下维持运转。平台的段敏老师和范宁娟老师在使用仪器上给我和我的学生提供了莫大的便利，让我们没有因为经费而减少或中断实验。到最后补实验的环节，郁飞和刘夏燕免费让我们用他们很贵很贵的培养皿做激光共聚焦。此时此刻，我账面上剩余的经费不足千元。只能说，对于我们这样的小课题组，原始创新的风险是巨大的。这条路很大的可能是越走越窄，以至于最终面临没有经费没有研究生的窘境。然而，我们终究是幸运的，终于活着看见了今天的朝霞。

这些年来，我的硕士生们一直陪伴我做这种未知前景的探索。因为他们的工作没有体现在这篇文章中，所以文章上也没有他们的名字。在这里我由衷地对他们表示感谢：朱孔利（10级），刘田田（10级），赵钰（11级），白玉（11级），欧艳梅（12级），周新宇（13级）。最后，还要特别感谢文章的第一作者，南昊（13级），他2016年硕士毕业后没有参加工作，一直在我们实验室做到现在。此间我也没有资助他，他撑不住的时候就出去挣点生活费，然后回到实验室继续干活。当年他敏锐地看到了这项研究的重大意义，并为此放弃了很多东西。让我感到慰藉的是，他也将在科学界获得应有的荣誉，prion历史上会有一句话：Nan et al. discovered the first virus-encoded prion.

断断续续、啰啰嗦嗦写了这么多，以此纪念曾经的激情燃烧的岁月。最后，用在上海开会时听到的一个非洲谚语结束吧：If you want to go fast, go alone. If you want to go far, go together.

2018.11.28 后记：2018年12月21日正式收到了文章的接收函，推测2019年元月能上线。

原文链接：

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注：文中参考文献为BioArt所加。

通讯作者简介：

许晓东副教授

据公开信息显示，许晓东副教授的经历不平凡。他于1967年生，1989年本科毕业于北京农业大学（现为中国农业大学），1989-1992年间在黑龙江省牡丹江制药厂任助理工程师，1995年又在北京农业大学获得硕士学位，1995-2000年间任中国科学院微生物研究所科技处职员、副处长、综合办公室主任，2001-2009年期间在英国雷丁大学（University of Reading）做Technician和Research Assistant，并于2009年在该校获得病毒学博士学位，主要从事杆状病毒表达系统、单链抗体（scFv）、HIV和口蹄疫基因工程疫苗的研究，2009年11月到西北农林科技大学生命科学学院工作至今。

参考文献：

1、Prusiner, S. B. Molecular biology of prion diseases. Science 252, 1515–1522 (1991).

2、Chakrabortee, S. et al. Luminidependens (LD) is an Arabidopsis protein with prion behavior. Proc. Natl Acad. Sci. USA 113, 6065–6070 (2016).

3、Yuan, A. H. & Hochschild, A. A bacterial global regulator forms a prion. Science 355, 198–201 (2017).

4、Shahnawaz, M., Park, K. W., Mukherjee, A., Diaz-Espinoza, R. & Soto, C. Prion-like characteristics of the bacterial protein Microcin E492. Sci. Rep. 7, 45720 (2017).

5、Xu X, Jones IM. 2004. Rapid parallel expression in E. Coli and insect cells: analysis of five lef gene products of the Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). Virus Genes. 29(2):191-197

6、Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A. & Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell 137, 146–158 (2009).

7、Xu X, Chen Y, Zhao Y, Liu X, Dong B, Jones IM, Chen H. 2013 Baculovirus superinfection: a probable restriction factor on the surface display of proteins for library screening. PLoS One. 8(1):e54631. doi: 10.1371/journal.pone.0054631

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