线粒体是细胞的“能量工厂”，其在细胞代谢和信号传导过程中起着至关重要的作用。人类线粒体基因组为长度 16.5 kb的环状mtDNA，具有37个基因和一个非编码的D环区，编码13种蛋白。遗传自母体卵母细胞的线粒体异质突变可以引发多种先天性疾病如母系遗传的Leigh综合征，并与迟发性复杂疾病相关。尽管目前通过二代测序技术（NGS）已经揭示了mtDNA的丰富多样性并提示mtDNA的异质性突变是造成大多数代谢疾病的重要因素，但由于传统测序技术的局限性，当前方法并不能描绘单个细胞中所有mtDNA的异质性及动态变化。因此目前对于mtDNA突变的了解仍然较为局限。2023年3月31日和4月4日，来自沙特阿拉伯阿卜杜拉国王大学（KAUST）李墨教授、美国SALK研究所Juan Carlos Izpisua Belmonte教授和北京大学第三医院于洋教授团队在Nucleic Acids Research杂志上以 Single-cell Individual Full-length mtDNA Sequencing by iMiGseq Uncovers Unexpected Heteroplasmy Shifts in mtDNA Editing 和 Quantitative Haplotype-resolved Analysis of mitochondrial DNA Heteroplasmy in Human Single Oocytes, Blastoids, and Pluripotent Stem Cells 为题连续发表两篇研究论文对上述领域的难题提出的解决策略。合作团队系统报道了一种可对单个细胞中的单独mtDNA进行完整高通量测序的单线粒体基因组测序技术（individual Mitochondrial Genome sequencing, iMiGseq），实现了对单个细胞中的单独的全长mtDNA进行无偏高通量碱基分析。参与此项国际合作研究还有广州医科大学附属第三医院范勇教授、北京大学生物动态光学成像中心黄岩谊教授等。利用该项技术，研究人员首次定量描绘了小鼠及人类单个卵母细胞及类囊胚中mtDNA的遗传学图谱，揭示mtDNA罕见突变导致的母系遗传疾病的分子特征，同时该技术为评估不同mtDNA编辑策略的安全性及临床胚胎植入前遗传诊断PGD提供新的思路及平台。基于研究人员前期已建立的单分子测序策略（individual-molecule sequencing, IDMseq），团队针对线粒体基因组特点进行进一步开发：通过优化细胞裂解流程富集DNA并减少mtDNA的丢失，利用聚合酶定向的唯一分子标签UMI特异性标记裂解细胞中的mtDNA，对标记的 mtDNA 通过高保真长距离 PCR 进一步扩增，并在长读长测序平台上测序获得全长 mtDNA，生成变异细节并解析单独 mtDNA 的完整单倍型，建立了单细胞水平对单mtDNA进行高通量测序的简明方案iMiGseq。iMiGseq使我们能够解决线粒体领域的几个关键的悬而未决的问题。研究人员利用基于Nanopore的三代测序技术准确表征了单细胞中mtDNA的异质性，并描绘了单个卵母细胞中mtDNA的遗传学特性。研究人员通过iMiGseq，对NARP/Leigh综合征患者来源的诱导多能干细胞iPSCs进行mtDNA的检测分析，揭示了致病性mtDNA有害突变的序列，其中包括单核苷酸突变（SNV）和大型结构变异（SV），并检测到单核苷酸突变SNVs中远低于传统检测阈值1%的变异等位基因频率（VAF）的罕见突变位点，iMiGseq揭示了患者细胞中不同的mtDNA致病突变的遗传联系，有助于理解线粒体疾病临床症状的复杂性。患者细胞中检测到的携带251-bp缺失和m.8993T>C致病突变的缺陷mtDNA示意图此外，目前研究广泛的多种线粒体基因编辑技术仍然缺乏有效的安全性评估手段。研究人员利用iMiGseq技术检测基于清除突变mtDNA的mitoTALEN方法编辑的细胞，发现了非预期的mtDNA异质性转移，而在检测基于修复突变mtDNA碱基的DdCBE方法编辑的细胞中没有发现明显的非预期突变。iMiGseq揭示了mitoTALEN编辑中意外异质转移的潜在风险，阐明了全长mtDNA单倍型解析分析在理解线粒体DNA异质性变化方面的优势，并证明了在分析mtDNA编辑结果时需要超灵敏的方法来评估编辑手段的安全性。以上结果表明，iMiGseq不仅可以帮助阐明线粒体相关疾病的病因，还可以评估各种mtDNA编辑策略的安全性。母体的线粒体是后代每个细胞中mtDNA的唯一来源，从卵母细胞遗传的异质性mtDNA突变是代谢疾病的常见病因，也与迟发性疾病有关。研究人员进一步利用iMiGseq技术，首次对单个人卵母细胞的全mtDNA异质性图谱进行了单mtDNA水平分析，在健康的单个人卵母细胞中鉴定出远低于常规方法检测阈值的罕见异质变异，提示线粒体疾病及癌症相关的罕见异质突变普遍存在于健康的人卵母细胞中，且可能通过女性的生殖细胞系发生种系遗传。单个人卵母细胞mtDNA SNVs与癌症（TCMA）及线粒体疾病（Disease）的相关性示意图
由于技术和伦理限制，目前对受精卵在人类发育过程中的mtDNA异质性的动态变化研究很少。研究人员利用iMiGseq技术，对人类naïve状态的诱导多能干细胞 (niPSC)诱导产生的类囊胚进行mtDNA图谱的描绘，对niPSCs及类囊胚进行变异分析发现在niPSCs及类囊胚中均未检测出结构性突变SV，并且在类囊胚生成过程中mtDNA异质性保持稳定。然而在对罕见变异位点进行分析时发现，类囊胚中存在MITOMAP中已经报道的与疾病相关的变异。尽管这些罕见变异对类囊胚发育的长期影响仍有待阐明，研究人员所开发的灵敏的iMiGseq方法有助于跟踪和研究罕见mtDNA突变的在发育中的动态变化，为胚胎植入前的遗传诊断PGD提供了一种新思路。除了对生殖细胞进行mtDNA的测序分析外，未来将iMiGseq用于检测体细胞mtDNA的突变信息，或可揭示mtDNA突变与衰老及相关疾病之间的相关性。类囊胚iMiGseq结果中罕见疾病相关突变的位点信息综上，iMiGseq方法的开发为精确描绘单细胞中mtDNA的完整单倍型提供了新的技术手段，为阐明线粒体突变相关疾病的病因，评估各种mtDNA编辑策略的安全性及临床胚胎植入前的遗传诊断PGD提供理想的平台及新思路，并为mtDNA遗传学研究提供新的见解，为理解生命发育初期mtDNA的异质性奠定了基础。人类类囊胚 （image credit: Mo Li, KAUST）https://doi.org/10.1093/nar/gkad208https://doi.org/10.1093/nar/gkad209制版人：十一
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