欧阳宏伟团队在软骨修复领域取得重要进展丨CellPress论文速递
关节软骨存在于关节表面，具有润滑、缓冲等作用，功能陪伴我们终生。然而，成人的关节软骨自身修复能力差，承重关节（如膝关节，髋关节）的软骨一旦损伤，难以自愈。若早期不进行妥善治疗，将导致疼痛、劳动力丧失、甚至残疾等。目前，关节软骨伤病已影响了全球数亿人，带来巨大的经济负担，但临床仍缺乏理想有效的治疗手段。
细胞移植治疗有望对软骨损伤进行早期干预，被喻为“黄金疗法”。在浙江大学欧阳宏伟团队之前的研究报导，自体软骨细胞移植可以治疗大面积软骨缺损（>6cm2），显著提升术后功能评分。然而，自体软骨细胞移植尚未在临床广泛应用，是受限于软骨种子细胞问题：1）足够数量的软骨细胞难以获得；2）透明软骨细胞“去分化”为纤维软骨细胞，体内移植难以恢复功能。
将成纤维细胞重编程为关节软骨细胞，可补充软骨细胞来源，并有望用于逆转软骨细胞纤维化的过程。转录因子的导入可实现细胞重编程，但将带来致癌、基因突变、操作难以标准化等风险。化学小分子化合物给药便捷，易于储存、运输，免疫排异轻，在实际应用中具有巨大优势。
为此，研究团队成功建立了成纤维-软骨细胞化学重编程体系。筛选获得小分子组合物VCRTc (valproic acid, CHIR98014, Repsox, TTNPB, 和Celecoxib)调控成纤维细胞表型；通过三维培养获得关节软骨标志物PRG4阳性软骨组织；利用高通量单细胞测序技术，解析成纤维-软骨细胞重编程多时间点的细胞表型动态变化，探究分子机制；利用体内关节软骨缺损模型，验证了诱导软骨细胞的体内功能，力学性能恢复至原来的63.4%。
2020年2月20日，浙江大学医学院欧阳宏伟教授团队在Cell Press细胞出版社旗下期刊Stem Cell Reports以长文形式发表题为“High-Resolution Dissection of Chemical Reprogramming from Mouse Embryonic Fibroblasts into Fibrocartilaginous Cells”的研究论文，报道了这一软骨修复领域的重要进展。
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组合式筛选小分子化合物组合
为找到能够成功实现成纤维-软骨细胞化学重编程的的小分子化合物组合，研究组利用小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs），根据已有文献，建立了“两步法”化学诱导模型。研究者进行了两轮筛选：初筛和组合式筛选，获得最终诱导方案。具体地，在诱导第一阶段，采用化学诱导培养基(含有小分子化合物valproic acid, CHIR98014, Repsox, TTNPB和Celecoxib)和低氧环境处理成纤维细胞；第二阶段，采用软骨分化培养基，进行成软骨诱导。最终通过软骨特异性表征，软骨细胞的得率约为1%（图1）。
图1：组合式筛选小分子化合物组合
三维仿生培养类软骨组织
由于软骨发育和表型维持受到力学微环境影响，研究者接着利用三维仿生培养，提高了软骨细胞诱导阳性率。研究团队采用pellet悬浮诱导三维模型，成功得到软骨标志物（ACAN，COL2, PRG4和SOX9）阳性的类软骨组织，其阳性率均大于20%（图2）。
图2：三维仿生培养类软骨组织
单细胞测序解析细胞动态表型
为进一步探究成纤维-软骨细胞化学重编程过程中，细胞的动态表型变化和潜在的分子机制，研究者利用单细胞高通量转录组测序，解析了其中约1400个细胞。结果发现，化学诱导的软骨细胞（chemical-induced chondrocytes, ci-chons）和小鼠原代软骨细胞表型相似，且高表达关节软骨表层标志物Prg4（图3）。研究者还发现，在诱导过程中第6天的“中间态”细胞（chemical-induced intermediate cells, ci-ICs）高表达软骨早期发育及软骨胞外基质重塑的基因；“中间态”细胞中存在的细胞亚群，和软骨发育过程细胞表型相似（图4）。
图3：单细胞转录组测序解析重编程细胞动态表型变化
图4：拟时间分析揭示“中间态”亚群具有软骨发育细胞特征
成纤维-软骨表型转化机制
研究者进一步验证了诱导早期“中间态“细胞的特征。他们发现，成纤维细胞原有的标志物在”中间态“细胞中已经显著减少，且Wnt、PI3K-Akt、Hippo等软骨发育相关通路激活。另外，通过有效抑制脂代谢相关基因，可进一步促进成纤维细胞早期重编程，提高最终的诱导效率。通多VCRTc单个化合物分别处理成纤维细胞的测序结果，他们发现TTNPB和Celecoxib作用显著。TTNPB是常用于化学重编程的生物活性小分子药物；Celecoxib是一种已临床用于骨关节炎治疗的抗炎药物（图5）。
图5：重编程早期成纤维细胞的表型转变
化学诱导软骨细胞修复体内软骨缺损
最终，研究者将化学诱导软骨细胞应用于小鼠体内原位软骨缺损的修复。和未移植细胞及移植成纤维细胞的关节表面组织相比，移植了化学诱导软骨细胞的关节表面，具有更佳的透明软骨形成和更少的纤维组织堆积。经过荧光示踪发现，新生软骨中超过60%来自于移植的化学诱导软骨细胞。通过纳米压痕力学测试，研究者发现，化学诱导软骨细胞的移植以有效使缺损部位软骨力学性能恢复至正常组的63.4%，而自发修复仅能恢复25%。结果表明，化学诱导软骨细胞具有修复软骨缺损的体内功能（图6）。
图6：化学诱导软骨细胞修复体内软骨缺损
总结
研究团队成功利用筛选获得的小分子化合物组合，诱导小鼠成纤维细胞为关节软骨细胞。这种化学诱导软骨细胞具有体内修复功能，可帮助关节软骨的力学功能恢复。利用单细胞高通量转录组测序，研究组描绘了成纤维-软骨细胞重编程过程中的细胞表型动态变化，并揭示了重编程早期抑制和激活的重要通路。该研究的发现，为未来软骨细胞再生治疗提供了可替代的种子细胞，也为关节软骨抗纤维化的药物治疗提供了理论基础。
该论文第一作者为浙江大学-爱丁堡大学联合学院博士后陈奕姗；共同第一作者为浙江大学医学院干细胞与再生医学中心专职研究员吴兵兵、浙江大学-爱丁堡大学联合学院博士生林俊鑫。该论文通讯作者为欧阳宏伟教授。
论文通讯作者简介
关于 欧阳宏伟 教授
欧阳宏伟是浙江大学医学院，教授、博士生导师。浙江大学求是特聘教授，英国爱丁堡大学荣誉教授。国际联合骨科研究学会（ICORS）会士、中国生物医学工程协会组织工程与再生医学分会主任委员。
欧阳宏伟教授代表性研究一览（上下划动查看）：
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相关论文信息
论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊Stem Cell Reports上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文
论文标题：
High-Resolution Dissection of Chemical Reprogramming from Mouse Embryonic Fibroblasts into Fibrocartilaginous Cells
论文网址：
https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711(20)30034-5
DOI:
https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2020.01.013
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