清华李丕龙团队巧用相变招募新技术绘制新冠病毒蛋白互作网络 | Cell Press对话科学家
生命科学
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2021年7月16日，清华大学李丕龙团队在Cell Press细胞出版社期刊Cell Reports上在线发表了题为“Compartmentalization-aided interaction screening reveals extensive high-order complexes within the SARS-CoV-2 proteome”的论文。他们开发了一套基于相变且适用于从细胞层面鉴定蛋白互作及高通量筛选互作调控物的新技术，名为CoPIC。并从细胞层面系统性地分析SARS-CoV-2病毒蛋白间的互作网络，并创造性地挖掘出多个潜在的高阶复合物，通过后续筛选靶向关键病毒蛋白互作的小分子化合物，将有望为干预新冠疾病提供更为高效快捷的新靶点及潜在的创新药物。
Cell Press细胞出版社微信公众号邀请论文作者对该研究进行了解读，旨在与广大科研人员深入分享该研究成果以及一些未来的展望，点击“阅读原文”或识别下图二维码阅读英文原文。
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病毒如何高效复制？复制/转录复合物如何形成？宿主的免疫反应如何逃逸？……诸如此类的一系列病毒生活史事件均离不开病毒蛋白间的相互作用。面对新冠肺炎在全球的肆虐，时间就是生命，如何快速、高效且准确地揭示SARS-CoV-2病毒编码蛋白间的相互作用关系，并筛选到靶向干预互作的小分子药物便成为了重中之重。以往常用的互作鉴定及小分子调控物筛选各自独立且均费时费力，均存在局限性。我们旨在开发一套基于相变且适用于从细胞层面鉴定蛋白互作及高通量筛选互作调控物的新技术，其名为CoPIC（Compartmentalization of Protein-protein Interactions in Cells）。作为一种简便高效且通用的工具，它巧妙地将互作鉴定及高通量筛选联系在一起，做到了“一体系多用途”。基于此，我们从细胞层面系统性地分析SARS-CoV-2病毒蛋白间的互作网络，并创造性地挖掘出多个潜在的高阶复合物，通过后续筛选靶向关键病毒蛋白互作的小分子化合物，将有望为干预新冠疾病提供更为高效快捷的新靶点及潜在的创新药物。
作者专访
Cell Press细胞出版社特别邀请论文作者李丕龙团队进行了专访，请他为大家进一步详细解读。
CellPress：
SARS-CoV-2利用复制/转录复合物(RTCs)，通过复杂的复制及组装机制来建立感染，了解其中的互作机制至关重要。请您介绍一下目前常规的互作检测方法的优缺点。
李丕龙团队：
虽然目前研究蛋白互作的技术很多，包括酵母双杂交、GST pull-down、免疫共沉淀等技术，但均存在着一定的优势及局限性。酵母双杂交技术是当前广泛用于蛋白互作组学研究的一种重要方法，可用于大规模筛选（已知/未知）的互作蛋白，但假阳性高，操作颇为繁琐，费时费力；GST pull-down则是一个行之有效验证酵母双杂交系统的体外技术，但无法反应细胞内蛋白的真实互作状态，且存在部分蛋白表达及纯化较为困难的限制；免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于确定两种蛋白在细胞生理条件下相互作用的有效方法，但无法鉴定直接或间接互作关系，即两种蛋白的结合可能并非直接互作，而是因为存在第三者在中间发挥桥梁作用。
CellPress：
本研究开发了一种新的基于相变的蛋白互作及高通量筛选体系(CoPIC)，请您介绍一下该技术的工作原理及优势。
李丕龙团队：
CoPIC是一套基于相变且适用于从细胞层面鉴定蛋白互作及高通量筛选互作调控物的新技术，其设计原理如下：（i）首先通过相分离建立能够在细胞中形成无膜区室的体系骨架，作为互作发生的场所；（ii）将待研究的蛋白互作对中的其中一个组分蛋白与相分离骨架连接在一起，确保该组分能在无膜区室中富集；（iii）通过检测蛋白互作对中的其它组分是否招募到无膜区室中，即可判断互作。综合比较已有的蛋白互作鉴定方法，CoPIC凭借其简洁性以及在特异性与效率之间的平衡脱颖而出。由于相分离液滴的形成可将相关蛋白聚集浓缩，因此发生在区室中的互作反应信号也被强烈放大，具有较高的灵敏度和信噪比。在特异性方面，招募进入区室并在其中进行浓缩需要能量输入以补偿由于浓度梯度而产生的熵减。这样，只有有效结合具有特定结合伴侣的分子才能被有效地募集，从而确保了CoPIC的特异性。而在效率方面，蛋白质相互作用的信号可以在细胞内轻松可靠地检测到，而无需进行耗时的体外实验（例如蛋白质纯化），从而确保了CoPIC的效率。
CellPress：
请问本研究利用CoPIC技术，发现了RTC相关病毒蛋白之间怎样的互作网络？
李丕龙团队：
独立于病毒粒子的组装，SARS-CoV-2的复制是由Nsps的多亚基复制/转录复合物（RTC）共同介导的。值得注意的是，N蛋白是目前唯一已知能自由穿梭复制工厂并促进病毒RNA转录和复制的结构蛋白。基于CoPIC技术，我们发现RTC相关病毒蛋白之间呈现一种交错并联的网状结构互作系统，即在复制工厂这一特定空间范围内，为实现高效复制/转录由相互联结的蛋白干线、联络线以及枢纽所构成的系统。其中，网络的核心组分依旧是RNA依赖RNA聚合酶 （Nsp12）、解旋酶（Nsp13）等参与病毒高效复制的RNA酶，但联络点则更多以辅助蛋白Nsp9（具有部分复制酶活性，可增强与核酸结合的亲和力）等为主。
CellPress：
利用CoPIC技术，本研究还鉴定到了大量的三元复合物，请问这说明了什么？
李丕龙团队：
谈到三元复合物，就不得不提CoPIC的另一大特色，即鉴定蛋白间的直接或间接相互作用。以免疫共沉淀技术为例，通过特异性识别拉下来的蛋白并不能都是与待检测蛋白有直接互作的蛋白，很多蛋白可能是通过其它蛋白的直接互作被拉下来，即与待测蛋白间接互作。如果不能准确区分直接互作蛋白与间接互作蛋白，则会对待测蛋白的互作关系产生误判，不能准确鉴定蛋白之间的互作关系。而CoPIC一方面能在无膜区室中大量富集互作蛋白，提高了检测的灵敏度，再者只有真实的相互作用才能克服浓度势垒，被富集到区室中，从而避免由非特异性蛋白互作引发的假阳性，故检测间接相互作用只需通过简单的三元共转染实验判断共定位与否即可。而本研究鉴定到的三元复合物，一方面丰富了我们对于病毒蛋白间相互作用网络的认识，另一方面也暗示大部分病毒蛋白需要通过伴侣蛋白的协助形成复合物之后才能充分发挥其功能。以RNA依赖RNA聚合酶（RdRp，又称Nsp12）为例，它是冠状病毒复制的核心组成成分，在病毒内催化病毒RNA的合成。虽然Nsp12本身能够以极低的效率进行聚合酶反应，而Nsp7和Nsp8这两个辅助因子的存在会显著促进其聚合酶活性，因此Nsp12-Nsp7-Nsp8复合体也被定义为介导冠状病毒RNA合成的最小核心组件。诸如此类的三元复合物还有很多，其中部分复合物的结构已得到了同行验证。
CellPress：
请问本研究所开发的互作筛选技术，能够为SARS-CoV-2的发病机制的理解和疾病治疗提供怎样的帮助？
李丕龙团队：
在过去一年多的时间里，人们对于SARS-CoV-2的研究取得了很大的进展，包括临床诊断与流行病学，分子进化机制、复制机制与组装机制，病毒结构与基因结构，以及病毒与宿主的互作等等，但是仍有大量的问题没有得到深入揭示。此外，目前对于新冠疾病尚无特效药，而已有的药物筛选研究也以阻断SARS-CoV-2与宿主的互作为主，尚无报道揭示病毒编码蛋白间的相互作用关系。对此，本研究着眼于病毒编码蛋白间的二元和多元相互作用关系，加深了我们对病毒蛋白协同调控感染的认识，并为治疗SARS-CoV-2感染提供新的靶点。
CellPress：
请问接下来您和您团队的工作重点在哪里？
李丕龙团队：
我们团队一直致力于实现生物大分子相分离的应用及转化，以CoPIC为例，后续工作将围绕以下两方面开展：（1）靶向关键病毒蛋白互作的小分子药物筛选。基于相分离原理，液相的流动性允许被招募蛋白在区室内以及区室与周围环境之间相对自由地运动，从而保证了招募的可逆性，而这种可逆性使得筛选一些特定蛋白互作的抑制剂成为可能。由于微观的蛋白互作及调控发生在液滴内且被转化为直观的荧光信号，因而具有可视性强、灵敏度高的优点。再者，操作过程简单易行且成本低廉，大大缩短了筛选时长。（2）探究未知蛋白复合体的互作模型。CoPIC可以对具有多个组分的蛋白复合体之间的互作关系、互作顺序进行探究，在相关复合体蛋白难以纯化、复合体结构难以解析的情况下，可以有效对复合体互作模式进行初步解析。（3）体系的优化升级。CoPIC主要用于检测已知蛋白互作以及疑似的蛋白互作，这限制了其在发现未知互作蛋白领域的应用。未来我们期望将CoPIC与邻近标记技术结合，用于无差别地筛选潜在的互作蛋白。
作者介绍
李丕龙
博士
李丕龙，博士，现任清华大学生命学院研究员，2000年本科毕业于北京大学，2002年获得香港科技大学硕士学位，2009年在德克萨斯大学西南医学中心获得分子生物物理学博士学位，2009-2015年先后在德克萨斯大学西南医学中心、宾夕法尼亚大学进行博士后训练，2016年加入清华大学生命科学学院工作至今。李丕龙实验室主要通过生物物理学、结构生物学、生物化学、细胞生物学 等方法研究“液-液分离相变（Liquid-liquid Phase Separation, LLPS）”在生物学上的意义，同时致力于开发基于LLPS的生化系统，用于在体外或体内研究任意分子互作，自从2020年新冠肺炎疫情爆发以来，其研究团队更是一直在科研第一线以独特的方式与病毒较量。李丕龙研究员曾参与提出蛋白质LLPS的概念，最早在体外建立相分离研究系统（Li et al. Nature, 2012），近期在研究“相变”与病毒、自噬、转录调控、表观遗传等领域做出了一系列重要工作，相关工作近期以通讯作者身份发表在Cell Reports / Protein & Cell/ Journal of Biological Chemistry / Cell Research / Molecular Cell / Nature等杂志上。
许伟凡
博士
许伟凡，博士，2014年本科毕业于武汉生物工程学院，随后进入浙江大学攻读博士学位，2019年进入清华大学开展博士后研究工作。博士期间主要从事昆虫杆状病毒囊膜蛋白的功能解析，目前致力于生物大分子液-液相分离的应用及转化研究。
裴高峰
博士生
裴高峰，清华大学2019级博士研究生。自加入李丕龙实验室后，开始探究RNA m6A修饰和其Reader蛋白的相变机制，相关工作已在2019年8月发表于Cell Research（共同一作）。2020年6月开始与许伟凡博士及刘泓睿博士生开展合作，使用CoPIC详细探究了SRAS-CoV-2转录复制复合物相关蛋白的互作网络，相关工作将刊登于最新一期Cell reports上。
刘泓睿
博士生
刘泓睿，2020年获得清华大学理学学士学位，现为美国约翰霍普金斯大学医学院博士生。本科期间于李丕龙实验室从事基于相分离的蛋白互作检测技术研究工作。
相关论文信息
论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell Reports上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文
▌论文标题：
Compartmentalization-aided interaction screening reveals extensive high-order complexes within the SARS-CoV-2 proteome
▌论文网址：
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00909-8
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109482
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