熊志奇团队揭示PRRT2基因突变导致发作性运动障碍病理机制 | Cell Press对话科学家
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2021年9月21日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心、上海脑科学与类脑研究中心熊志奇团队，在细胞出版社旗下期刊Cell Reports以长文形式发表了题为“小脑去极化扩布介导发作性运动障碍”（Cerebellar spreading depolarization mediates paroxysmal movement disorder）的研究论文，揭示了PRRT2基因突变导致发作性运动障碍的病理机制。
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发作性运动诱发性运动障碍（paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD）是最常见的发作性运动障碍疾病，主要表现为突然运动诱发的舞蹈症、手足徐动症、投掷症、肌张力障碍等非自主运动。由于和癫痫发作在症状上有一定相似性，该疾病在临床实践中常被误诊为癫痫。2011年，吴志英团队与王柠和陈万金团队及熊志奇团队合作，在国际上报道了PKD的第一个致病基因PRRT2。该致病基因的发现为动物模型的构建和疾病机理的研究奠定了基础。熊志奇研究组在发作性运动障碍病理机制的研究过程中，发现PKD模型小鼠小脑皮层对去极化扩布（spreading depolarization，SD）极其易感，并且运动障碍总是紧随小脑去极化扩布而发生。基于该发现以及小脑在运动和身体姿势调节方面的重要作用，研究团队首次提出了发作性运动障碍的“小脑去极化扩布”假说。
去极化扩布最初由ARISTIDES A.P. LEÃO博士于上世纪四十年代发现并报道。他发现给兔子大脑皮层施加一串局部电刺激（1-5秒）之后，在远离刺激电极方向线性排列的记录位置，会先后被记录到长达数分钟脑电活动的消失，而且距离刺激部位越远的位置，脑电消失发生的越迟。LEÃO博士根据此观察结果推测，电刺激在大脑皮层诱导了一个具有传播特质的事件，并根据其对脑电活动产生抑制这一后果将该事件命名为扩布性抑制（spreading depression）。后续的研究证明在大脑皮层中介导“扩布”的是细胞外高浓度的兴奋性物质，如钾离子。这类物质在神经细胞群体去极化过程中产生并迅速于细胞间隙累积，随后向外扩散形成可再生的去极化波。去极化波经过的区域，神经细胞会发生强制性去极化并伴随细胞水肿，最终导致神经活动被抑制。LEAO博士观察到的现象就是去极化波带来的后果。
入选Cell Reports最新一期封面
在人类大脑组织中，去极化扩布一般只在病理状态下发生。通常由局部刺激诱发并在大脑灰质区缓慢扩布，常伴发于急性脑损伤、局灶性缺血以及先兆型偏头痛等。基于实验动物的研究表明，在特定条件下，去极化扩布可以在大脑皮层，海马，纹状体，脑干以及小脑等脑区被诱导，但是不同脑区对于去极化扩布的敏感程度有较大差异。大脑皮层和海马组织对去极化扩布较为易感，而小脑皮层则对此事件有很强的抗性。小脑为何会成为扩布性去极化的“避风港”？假如在小脑皮层发生去极化扩布，在行为上会出现什么后果？
熊志奇团队的这项研究为该谜团提供了颇具信服力的答案。该项研究表明，小脑颗粒细胞中的PRRT2蛋白在小脑抵抗扩布性去极化的过程中扮演了重要角色。PRRT2通过延缓失活状态钠离子通道的恢复降低神经元的持续兴奋能力，以此阻止局部刺激诱导小脑皮层中去极化扩布的发生和传播。相反，敲除Prrt2基因则可以使小脑皮层处于去极化扩布敏感状态。在这种状态下，局部刺激小脑皮层即可有效诱发去极化扩布。该项研究进一步证明，局部产生的去极化波几乎能够传遍整个小脑皮层，并通过浦肯野到小脑深部核团的神经连接干扰该环路中神经元的正常发放，最终导致运动障碍的发生。
熊志奇团队的这项研究工作不仅深入剖析了PKD的病理机制，还为去极化扩布的敏感性调控提供了新的细胞分子机制。该项研究由熊志奇研究员指导，陆斌、娄森森、徐若水、孔德伦、吴荣杰和张静等团队成员合作完成。研究生庄凌、吴雪妹和何俊彦以及浙江大学医学院吴志英教授参与了该研究。
PRRT2缺失或功能缺陷可以通过增强钠离子通道功能使小脑皮层对去极化扩布易感。去极化扩布在小脑皮层的传播干扰小脑浦肯野-深部核团环路功能并最终导致发作性运动障碍。
作者专访
Cell Press细胞出版社特别邀请熊志奇教授代表研究团队进行了专访，请他为大家进一步详细解读。
CellPress：
阵发性运动诱发性运动障碍（PKD）是最常见的阵发性运动障碍，而PRRT2已被鉴定为PKD的主要致病基因。请问您是如何发现PKD与小脑去极化扩布（SD）之间的关联的？
熊志奇教授：
小鼠PKD模型没有表现与患者类似的自发运动障碍。我们尝试了各种刺激诱导的方式。将两者联系起来的想法最初源自实验中的一个偶然的发现。我们给PKD模型小鼠进行小脑皮层微量给药的过程中，发现仅需将极细的注射针插入小脑皮层即可诱发模型小鼠的运动障碍，该运动障碍具有发作性特征，小鼠在发作数十秒之后即可恢复正常行动。同样的操作在正常小鼠中则完全不会引起任何运动异常。而且从刺激到运动发作有30-60秒的延迟。这个现象引起了我们极大的兴趣，注射针插入皮层的操作和诱发大脑皮层SD事件的经典刺激手段（针刺）类似。于是我们推测，在PKD模型小鼠的小脑皮层可能也产生了类似的SD事件，而且SD可能触发了随后的发作性运动障碍。根据经典的SD检测方法，我们随后利用电生理和荧光钙成像技术在PKD模型小鼠小脑皮层检测到了刺激诱导的SD事件，并进一步证实了小脑SD事件与发作性运动障碍的因果关系。
CellPress：
请问PRRT2缺失是如何促进SD的？
熊志奇教授：
影响SD产生和扩布的因素主要有两个方面，一是神经细胞接受局部刺激时释放兴奋性因子的能力（如钾离子和谷氨酸神经递质等），二是细胞外兴奋性因子被清除的效率。神经元兴奋性受细胞外钾离子浓度调控。神经细胞在受刺激过程中会释放钾离子, 导致细胞外钾离子浓度升高，而这些胞外的钾离子能进一步刺激神经细胞并使其释放更多的兴奋性物质。这种形式的兴奋性正反馈使最初的刺激效应被迅速放大，局部兴奋性物质浓度急剧升高，并与周边区域形成化学浓度梯度，导致兴奋性因子向外扩散。向四周扩散的兴奋性物质再次刺激所过之处的神经细胞，扩增效应被不断重复，最终形成扩布性去极化波。PRRT2主要影响第一个因素，也就是神经细胞受到持续刺激时释放兴奋性物质的能力。我们在实验中发现，PRRT2缺失会导致小脑颗粒细胞持续响应刺激的能力增强，从而释放更多的钾离子到胞外，使小脑皮层更容易产生SD。
CellPress：
请问钠离子通道在SD中发挥怎样的功能？
熊志奇教授：
电压门控钠离子通道是神经元动作电位产生的基础, 在神经元响应刺激的过程中起重要作用。细胞受到刺激发生去极化时钠通道会经历“关闭-开放-失活”的过程，之后钠通道需要从失活状态恢复至正常的关闭状态才能被再次激活。我们发现PRRT2对钠离子通道从失活到恢复这一环节起重要的调节作用。PRRT2蛋白能够延缓钠离子通道从失活到正常关闭状态的转换，以此减弱神经元对连续刺激做出响应，使局部兴奋性物质浓度无法达到SD诱发的阈值。相反，PRRT2缺失则会加速钠离子通道从失活状态的恢复，增强神经细胞的兴奋性，从而促进小脑皮层SD的产生。我们的研究还发现，用药物阻断钠离子通道可以有效抑制SD的产生，并阻止PKD模型小鼠运动障碍的发作。
CellPress：
请问SD是如何通过小脑深部核（DCN）神经元来影响运动障碍的？
熊志奇教授：
小脑主要由小脑皮层和小脑深部核团（DCN）组成。小脑颗粒细胞-浦肯野细胞-深部核团神经元构成主要的小脑神经环路。DCN作为小脑向运动控制环路输出调节信息的重要节点，对身体姿势的维持和运动的协调性起着极其重要的作用。起始于小脑皮层（分布有颗粒细胞和浦肯野细胞）局部区域的SD，在小脑皮层的灰质区缓慢扩布（1.5-3 mm/min），使大量颗粒细胞和浦肯野细胞持续去极化，并导致浦肯野细胞发生去极化阻滞而停止规律的神经元放电。由于浦肯野细胞的神经纤维直接投射到小脑深部核团，SD通过此神经连接对深部核团神经元的活动产生干扰，最终导致运动障碍的发生。值得注意的一点是，SD无法穿越小脑皮层和深部核团之间的白质区，因此SD对小脑深部核团神经元的影响和对浦肯野细胞神经元的作用存在区别。
CellPress：
本研究发现了SD在PKD中发挥重要作用，请问该研究成果能够为理解PKD的发病机理及治疗提供怎样的帮助？
熊志奇教授：
PKD属于发作性神经系统疾病，患者的临床症状已得到较为全面的阐述，但是PKD疾病发作起始，发展和终止的病理机制一直不清楚。PKD模型动物中小脑SD事件的发现为PKD病理机制的研究提供了理论指导，也为PKD疾病的干预和治疗提供了新的思路。抑制SD的手段和方法将能有效控制PKD的症状。
CellPress：
请问接下来您和您团队的工作重点在哪里？
熊志奇教授：
PRRT2对神经活动依赖的钠离子通道的调控作用具有重要的临床和基础科学的意义。神经元的过度兴奋参与许多神经疾病的发生发展, 包括癫痫和神经痛等。目前，我们对PRRT2分子的了解仍很初步，我们团队后续工作重点之一将放在PRRT2生物学功能的解析，这部分工作对了解其作用机制非常重要，对后续开发新的药物也能起到指导作用。
另外，临床上仍有部分PKD患者, 尤其是一半以上的散发性患者，未检出PRRT2基因突变，意味着PKD还有其它的致病基因尚未被发现。就在今年，我们和吴志英团队再次合作，发现了PKD的第二个致病基因TMEM151A。我们后续工作的另一个重点是对TMEM151A相关的PKD病理机制进行深入研究。
通讯作者简介
熊志奇
教授
熊志奇，2000年获贝勒医学院药理与神经科学博士学位；2000-2003年杜克大学神经生物学系博士后；2003年至今任中科院神经科学研究所研究员、博士生导师，2012年晋升为高级研究员。2014年起任中国科学院大学和上海科技大学兼职教授。担任Developmental Neurobiology、Neurobiology of Disease等杂志的编委。课题组利用基因操作小鼠和非人灵长类模式动物，研究脑疾病的分子、突触和神经环路机制。发表论文80余篇。
相关论文信息
研究成果发表在Cell Press旗下Cell Reports期刊上，点击“阅读全文”或扫描下方二维码查看论文。
▌论文标题：
Cerebellar spreading depolarization mediates paroxysmal movement disorder
▌论文网址：
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)01196-7
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109743
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