CRPS封面文章：工程化活凝胶用于纯有机溶剂中的增强生物催化 | Cell Press论文速递

物质科学

Physical science

同济大学胡勇教授、德国亚琛工业大学Johannes Schiffels和李鑫博士等人在Cell Press细胞出版社期刊Cell Reports Physical Science上发表了题为“Engineered living hydrogels for robust biocatalysis in pure organic solvents”的研究论文，该论文已于9月12日作为封面论文正式在线发表。该项研究将转基因大肠杆菌整合到海藻酸水凝胶中制备了活凝胶，并实现了活凝胶在纯有机溶剂中的增强生物催化。

同济大学胡勇教授、德国亚琛工业大学Johannes Schiffels和李鑫博士为本论文的共同通讯作者，高亮、冯历琳为论文第一作者。本研究得到了国家自然科学基金、中德合作项目、中央高校科研专项和中国留学基金委等资助。

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研究介绍

化学选择性合成在工业中间体、手性药物、食品添加剂中是高度需求的，但也是一个重大的挑战。酶催化剂在化学选择性合成具有先天优势，但其对高浓度疏水性化合物（如底物或有机溶剂）的耐受性是十分有限的。尽管，全细胞催化剂被开发用于保护内部酶从而提高生物催化效率。然而，全细胞催化剂并不是通用的策略，它们在纯有机溶剂中往往也是失活的。比如，在单取代苯的羟基化（工业中间体的重要反应）中，由于底物的高毒性，全细胞催化剂不能达到令人满意的催化活性。因此，迫切需要一种通用的策略来提高生物催化剂的有机溶剂耐受性。

工程化活材料被认为是材料科学和工程领域最相关的当代革命，并在实际应用中可超越现有的智能、活性或多功能材料。鉴于其特殊重要性，欧盟委员会最近发起了关于工程活材料的 EIC 探路者挑战赛，以促进研究人员在这一新兴领域前沿的探索。其中，水凝胶因其独特性能已被用作活细胞培养的基质，这催生了工程化活凝胶的新兴领域。水凝胶的生化渗透性能够支持活细胞的正常代谢功能。此外，水凝胶的结构特性还可以在空间上限制活细胞的行为，同时保护其免受恶劣环境的影响。然而，迄今为止尚未探索工程化活凝胶在生物催化领域的应用。

在本研究中，活凝胶是通过整合转基因大肠杆菌全细胞来设计的，并将其用于单取代苯在纯底物或纯有机溶剂中的邻羟基化（图1）。该水凝胶基质是生物相容的，能够维持细胞生长、减少细胞逃逸和提高有机溶剂耐受性，从而延长细胞活性。此外，水凝胶微环境包括含水量、钙离子浓度和网络疏水性，能够进一步调整活凝胶的生物催化效率。与游离细胞相比，工程化活凝胶（C-gels）在多种有机溶剂中展现出提高的溶剂耐受性和生物催化能力。总之，C-gels实现了在纯有机溶剂中的增强生物催化，这标志着生物催化领域的活凝胶创新的开端。

图1 工程化C-gels的构建及其用于将甲苯转化为邻甲酚示意图

将活的大肠杆菌细胞悬浮在海藻酸盐溶液中，并通过注射器滴加到Ca(II)溶液中，交联形成工程化的C-gels。Cryo-SEM显示C-gels具有典型的3D交联网络（图2B）。C-gels中的细胞生长速率与培养基中游离细胞的生长速率相似（图2C），表明水凝胶基质的生物相容性和水合微环境允许营养物质、抗生素和代谢物的扩散。此外，具有高Ca(II)交联度的C-gels能够减少细胞逃逸到周围培养基（图2D）。经基因改造的大肠杆菌细胞（共表达LbADH和P450 BM3 M2）具有生物催化能力（图2F）。BCCE测定法结果表明，C-gels具有优异的细胞活性（图2E）。

图2 工程化C-gels的制备及其细胞生长、逃逸和生物催化应用

接下来，课题组研究了反应溶剂中的缓冲液含量对C-gels的生物催化效率的影响。结果表明，适当水性介质可以提高游离细胞的催化效率，但反应溶剂形成的有机/水双相体系对下游分离具有挑战性。在纯甲苯中，C-gels中得到的邻甲酚量比游离细胞多出2.7倍，表明C-gels本身的水合微环境有利于增强纯甲苯中的生物催化（图3A,B）。C-gels和游离细胞的最大产物量之比在60分钟时达到了5.9倍（图3C）。此外，C-gels在4h内显示出更高的生物催化效率（图3D）。经纯甲苯浸泡后的游离细胞是完全失活的，而C-gels仍保持细胞活性（图3E,F）。这些结果表明，C-gels具有优异的有机溶剂耐受性，可以保护细胞免受甲苯的侵害，从而延长其在纯底物中的生物催化效率。

图3 游离细胞和C-gels在纯甲苯中的生物催化效率和细胞活性

此外，课题组还探索了C-gels包括水含量、Ca(II)浓度和疏水性的微环境对催化活性的影响。冻干的C-gels在纯甲苯中没有催化活性，而随着缓冲液的增加，邻甲酚产量先增加后减少（图4A）。这一结果表明，新鲜制备的C-gels的水合微环境对于其在纯底物中实现最佳生物催化活性是至关重要的。其次，与含缓冲液的游离细胞相对，C-gels在纯甲苯中获得更高的邻甲酚产量，表明C-gels具有保护作用，进一步提高其在纯底物中的生物催化效率（图4B）。另外，疏水改性的C-gels使得生物催化效率显著降低。最后，经Ca(II)处理后的游离细胞能生成更多的邻甲酚。这是由于Ca(II)介导了细胞外基质中脂多糖的交联而形成致密细胞膜，从而提高其有机溶剂耐受性和生物催化效率。然而，当这些细胞经过洗涤后，由于细胞环境中Ca(II)的流失，邻甲酚的产量减少到未处理细胞的水平（图4C）。重要的是，C-gels的生物催化效率经洗涤后并未降低，由于Ca(II)被配位在水凝胶网络中。因此，Ca(II)不仅对C-gels的形成是重要的，而且有利于提高C-gels在纯甲苯中的生物催化效率（图4D）。

图4. 不同水凝胶微环境下C-gesl的生物催化效率

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论文原文刊载于CellPress细胞出版社旗下期刊Cell Reports Physical Science上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文

▌论文标题：

Engineered living hydrogels for robust biocatalysis in pure organic solvents

▌论文网址：

https://www.cell.com/cell-reports-physical-science/fulltext/S2666-3864(22)00348-4

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.xcrp.2022.101054

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