Trends Biotech首批原创研究上线 | 杨世辉团队建立工业菌株通用基因组高效编辑工具包及一站式知识数据库平台
生命科学
Life science
近日，湖北大学杨世辉教授团队在Cell Press细胞出版社旗下期刊Trends in Biotechnology上在线发表了题为“Efficient Genome-Editing Tools to Engineer the Recalcitrant Non-model Industrial Microorganism Zymomonas mobilis”的研究论文，该研究以运动发酵单胞菌为范例，建立了工业菌株通用基因组高效编辑工具包及整合系统生物学信息的一站式知识数据库平台ZymOmics (http://zymomics.cn/)。有助于研究人员建立工业菌株高效基因组编辑工具，扩大对工业菌株的理解并充分利用它们的特性来构建高产稳产微生物细胞工厂。
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研究亮点
建立了针对非模式工业菌株运动发酵单胞菌的一站式菌株特异性数据库平台ZymOmics，包括用于挖掘内源限制-修饰（R-M）系统、CRISPR-Cas系统、毒素-抗毒素（T-A）系统、质粒复制系统等生物元件的计算流程；对非模式微生物知识数据库建立及高效基因组编辑系统开发具有指导意义。
整合内、外源CRISPR-Cas系统，建立全基因组连续循环基因编辑系统（Genome-Wide Iterative and Continuous Editing system，GW-ICE），实现了PAM位点全基因组覆盖、编辑质粒高效转化及编辑后无需丢失编辑质粒的快速连续基因组编辑；为缺乏高效基因组编辑系统的非模式工业菌株改造提供了参考。
利用GW-ICE系统构建了鲁棒性增强的运动发酵单胞菌基因组精简6.5%的菌株ZMNP∆hypo，为运动发酵单胞菌最小基因组菌株构建奠定了基础。
图1：全基因组连续循环基因编辑工具的元件挖掘及工具建立和优化
研究简介
高产稳产工业菌株是生物制造 “芯片”，有助于实现化工、医药、食品、农业等产品高效、绿色、低碳、可循环生产。目前工业菌株的研究与应用主要集中在大肠杆菌、酿酒酵母等数据和遗传工具丰富的少数模式菌株，天然非模式工业菌株拥有众多工业生产优良特征，但因数据与遗传改造工具匮乏等问题制约了菌株的改造与应用，难以满足生物制造对高产稳产工业菌株的需求。
运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）和酿酒酵母是自然界二种乙醇天然生产菌株。酿酒酵母是模式菌株，而运动发酵单胞菌则为非模式工业菌株，研究和应用都相对较少。但运动发酵单胞菌是目前唯一已知可在厌氧条件下通过ED代谢途径生长的微生物，葡萄糖转化效率与乙醇得率比酿酒酵母高（98%）；同时，它作为兼性厌氧菌株，培养要求和发酵条件简单，容易实现工业放大，美国杜邦公司就利用其重组菌株作为年产3千万加仑纤维素乙醇生产线的细胞工厂；由于其基因组小，代谢简单，厌氧发酵条件下几乎全部碳源转化为乙醇，几乎没有任何副产物，下游分离纯化简单，成本低；另外，其耐酸能力强、生长温度范围广，利用纤维素水解液生长时候不需要调节pH，同时由于菌株的多倍体基因组特性使基因组稳定而不易退化，也无噬菌体污染的倒罐风险，可大幅降低大规模工业发酵生产成本。但其多倍体特性及基因组稳定性也为菌株的改造和迭代带来了挑战，限制了以其为底盘细胞构建利用多种原料生产除乙醇之外多元产品的高效生物炼制工厂。
该研究以运动发酵单胞菌为范例，建立了整合系统生物学信息的一站式知识数据库平台ZymOmics (http://zymomics.cn/)。该数据库整合了运动发酵单胞菌基因组、基因组重测序、蛋白结构、转录组及蛋白组等数据，并包括了一个用于挖掘内源限制-修饰（R-M）系统、CRISPR-Cas系统、毒素-抗毒素（T-A）系统、质粒复制系统生物元件的工作流程（http://ZymOmics.cn/CRISPR_TA_RM）及全基因组代谢模型（图2）。
图2：一站式信息检索数据库ZymOmics遗传工具元件挖掘。（a）ZymOmics的组成及应用。（b）Z. mobilis ZM4中R-M、CRISPR-Cas、T-A、复制系统候选元件在染色体和4个内源质粒上的位置排列。（c）R-M、Cas、T-A、复制酶在ZymOmics中转录组数据分析平台的转录水平。
通过对运动发酵单胞菌内源4个系统生物元件挖掘，并结合这些元件构建了全基因组连续循环基因编辑工具（Genome-Wide Iterative and Continuous Editing (GW-ICE)）（图3）；与传统CRISPR-Cas系统相比，该系统1轮3个基因编辑从12.5天缩短为5天，6轮基因编辑从75天缩短为26.5天。该研究进一步利用GW-ICE工具对运动发酵单胞菌实施基因组精简，实现了4个内源质粒及基因组部分未知功能基因的高效敲除，构建成功基因组精简6.5%的精简菌株ZMNP（图3）；该菌株具备更高的外源DNA转化效率，并提高了在木糖二次母液中的鲁棒性能及乙醇生产速率。本研究也探究了高效基因组编辑生物元件在不同宿主中的适配性，为遗传信息和工具缺乏的非模式工业菌株的元件挖掘、编辑系统构建提供了范例；助力高产稳产细胞工厂设计构建及生物制造发展。
图3：运动发酵单胞菌GW-ICE系统的构建及应用。（a）结合内源I-F型CRISPR-Cas及外源CRISPR-Cas12a系统的GW-ICE示意图。（b）GW-ICE与传统CRISPR-Cas系统完成1次及6次基因编辑所用时间的比较。（c）运用GW-ICE构建精简菌株ZMNP∆hypo的过程示意图。（d）Z. mobilis野生型菌株ZM4及突变株ZMNP的形态比较。（e, f）利用Hi-C技术鉴定Z. mobilis ZM4和ZMNP的染色体及质粒分区。
作者专访
Cell Press细胞出版社公众号特别邀请杨世辉教授进行了专访，为大家进一步详细解读。
CellPress：
您认为这项研究最大的亮点是什么？
杨世辉教授：
这项研究以乙醇生产菌株运动发酵单胞菌为研究对象，整合系统生物学信息数据和分析工具建立了一站式知识数据库平台ZymOmics，开发了高效的基因组编辑工具，建立了工业菌株高效基因组编辑工具包，并利用该系统构建了一个鲁棒性增强的基因组最小化菌株ZMNP，作为大有前景的纤维素生物炼制底盘细胞。本研究可以帮助建立工业菌株尤其是研究较少的非模式工业菌株通用基因组编辑工具包，加快工业菌株理性设计与改造，扩大我们对工业菌株的理解，并利用它们的特性构建高产稳产细胞工厂，助力生物经济发展。
CellPress：
您认为这项研究将会带来哪些社会效益？
杨世辉教授：
这项研究可以帮助开发和应用高效的基因组编辑技术和研究较少的基因稳定型微生物的知识数据库平台，这对于将其转化为高效的生物炼制底盘细胞至关重要，可以加速微生物细胞工厂的发展，以利用可持续的原料进行生物制造。这有助于将目前以石油为基础的经济转变为循环生物经济，实现环境保护、能源安全和碳中和的目标。
CellPress：
请与我们分享一下您在Trends in Biotechnology发表研究论文的体验。
杨世辉教授：
Trends in Biotechnology是一本久负盛名的生物技术期刊，得知它的征稿范围从review / opinion扩展到research / resource类型的文章，我们都很高兴，我们相信这将有利于生物技术研究群体。我们也非常荣幸能够在此首次发表research / resource类型的文章。主编Matthew Pavlovich博士等编辑们非常专业，知识渊博，他们及时回应并提出了很好的建议，这大大改善了我们稿件的结构，组织和呈现形式。
作者介绍
耿碧男
博士后
耿碧男，博士，湖北大学博士后。主要从事工业微生物基因编辑育种等合成生物学技术与应用研究，特别是基于运动发酵单胞菌的生物元件筛选及基因组编辑等菌株改造技术。先后在Synthetic and Systems Biotechnology、Front Bioeng Biotechnol、《合成生物学》与《生物工程学报》等期刊发表论文10篇；授权中国发明专利4项。
何桥宁
副教授
何桥宁，博士，副教授。湖北省首期“青年拔尖人才培养计划”项目获得者，湖北省合成生物学学会理事。主要从事利用合成生物学、代谢工程等手段进行生物能源与生物材料等平台化合物的合成生物制造研究。作为项目负责人主持国家级项目3项，先后在Green Chem、Chem Eng J、Metab Eng、Bioresour Technol等期刊发表SCI文章20余篇，授权国内外发明专利7项。担任Biodesign Research青年编委。
杨世辉
教授
杨世辉，博士，湖北大学教授，博士生导师，“省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室”副主任，湖北省“楚天学者”特聘教授，武汉睿嘉康生物科技有限公司创始人；中国生物发酵产业协会理事会理事，中国化工学会生物化工专委会委员，中国微生物协会分子微生物学及生物工程专业委员会委员，全国技术产品文件标准化技术委员会第二届通用规则分技术委员会委员；湖北省合成生物学学会副理事长兼秘书长，湖北省生物工程学会理事会理事。毕业于湖北大学（生物学学士，1993年），武汉大学（微生物学硕士，2000年），及美国加州大学河滨分校（微生物学博士，2005年）。曾先后任职美国能源部橡树岭国家实验室副研究员（Research Associate，2007~2011）及美国国家可再生能源实验室研究员（Staff Scientist，2011~2016）。2016年底加入湖北大学生命科学学院，主要从事微生物系统与合成生物学以及绿色生物制造等方面研究；主持科技部合成生物学重点研发计划、自然科学基金面上、联合项目等多项国家及省部级项目；先后在Nature Biotechnology、Trends in Biotechnology、PNAS、Nucleic Acids Research等期刊发表论文 120多篇，引用5100余次，H-index 40。获美国授权发明专利7项、中国发明专利授权23项、专利转让17。担任Biodesign Research共同执行主编及《合成生物学》与《生物工程学报》等期刊编辑与编委。
相关论文信息
论文原文刊载于Cell Press细胞出版社
旗下期刊Trends in Biotechnology上，
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▌论文标题：
Efficient Genome-Editing Tools to Engineer the Recalcitrant Non-model Industrial Microorganism Zymomonas mobilis
▌论文网址：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0167779924001240
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2024.05.005
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Cell Press Multi-Journal Submission（点击查看）的前身Cell Press Community Review模式于2021年推出。对于通过Cell Press Multi-Journal Submission“多刊审稿”模式投稿的作者，我们将提供稿件被多本期刊同时考虑的机会。超过80%通过Cell Press Multi-Journal Submission“多刊审稿”模式投稿的文章获得了至少一个或多个期刊的评审。
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