IND前的大考-抗体药生物分析与临床前安全评价
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2021年10月23-24日，bioSeedin柏思荟最受欢迎的抗体药研发Workshop模块四《抗体药物生物分析与临床前安全性评价》在上海张江如期举行。
本次交流会和我们分享的嘉宾有复宏汉霖生物分析总经理邹灵龙博士，康龙化成免疫学和特殊毒理学副总裁姜颖博士，吉因加转化医学总监李进， 熙宁生物高级技术总监朱国振和上海益诺思高级总监陈建军博士。
10月23号上午，复宏汉霖生物分析总经理邹灵龙博士首先为大家带来《抗体药PK研究方法开发》的分享。邹博士以FDA批准的治疗性抗体的PK profiles开场，给大家详细的阐述了抗体的特性，包括靶点非依赖性的降解、pH依赖的FcRn介导的半衰期以及TMDD（Target mediated drug disposition）。目前批准的抗体药以IgG1、IgG4、IgG2为主，为什么不采用IgG3呢，邹博补充到IgG3的FcRn亲和力弱，半衰期只有9天，考虑到药代动力学需要更频繁的给药，所以很少选择用来开发抗体药物。
关于半衰期，邹博以Ravulizumab为例，表示通过antibody engineering（M428L and N434S）提高FcRn介导的抗体循环的效率，延长半衰期至49.6天。
随后，邹博分享第二部分PK assay的设计和开发。在开发LBA method的时候，需要考虑药物结构，比如FC融合蛋白没有Fab，mAb结合的靶点标签（His or Fc tag）和轻链亚型（Kappa or lambda），双抗药物需要设计total 和 intact assays，ADC需要定量intact drug和单独的抗体部分，并且邹博进行了详细案例的分享。讲到这里，邹博鼓励大家进行提问交流，如进行关于FcRn体外亲和力数值和半衰期对应关系，MRD设定，单抗和双抗的检测区别等等，大家进行了充分地讨论。
茶歇后，邹博以多个数据阐述了抗体药PK Method 需要考虑的因素，包括LLOQ, ULOQ, specificity, matrix effect, carry-over effect, robustness, short term stability, long-term stability等。最后，邹博带来FDA、EMA/NMPA和ICH 关于guideline for PK assay validation的解读，关于法规，大家又进行了一次热烈的讨论。邹博结合自己多年的PK开发经验，热情的分享，激烈的讨论，给大家带来很多新思路拓展。
02
抗体药临床前安全性评价研究
10月23号下午，康龙化成免疫学和特殊毒理学副总裁姜颖博士为大家带来《抗体药临床前安全性评价研究》的分享。在确定使用参考法规之前，要明确药品类别的定义，如Biological product, Protein, Chemically synthesized polypeptide, Peptide的不同之处，姜博强调只要是Biologics，建议做免疫原性分析。在IND前，需要做相关种属分析，一般的毒性研究持续时间在clinical phase 1 to phase 3 和BLA持续时间是不一样的。关于给药方面，有不同的给药途径，动物实验尽量选择和临床一样的给药方式。随后，姜博通过案例来说明如需更换给药方式，在剂量选择方面需要考量的因素。另外，姜博表示所有的体外体内数据都是有用的，可以结合临床数据一起分析。对于Biologics，有一些特殊考虑点，safety pharmacology, Carcinogenicity, Reprotox。那怎么选择相关种属，姜博结合法规，进行了说明，那如果没有相关种属呢，大家进行了递进式的讨论，可以选择模式动物或者替代分子（和原研分子的相似度，需要的是生物学功能的相似，而不仅仅是序列上），这个数据对最终的临床试验怎么参考。关于免疫毒性，可以通过STS（standard toxicity study）进行评估，如血液学改变、免疫系统器官重量或组织病理学改变、血清球蛋白的不合理变化、感染增加或肿瘤发病率增加。同时，与适当的其他研究一起评估潜在的免疫毒性，如TDAR( T细胞依赖性抗体反应)，通过引入外来抗原如KLH，反应药物对免疫系统的整体的影响；CRA（细胞因子释放试验），使用PBMC样本，在体外检测细胞因子分泌；ADCC, CDC assay等。
茶歇后，姜博带来实际案例的分享，其中关于靶标干扰，药物干扰及其解决方案，进行了详细的展示，也给大家带来新的思路。整个分享过程中，大家随时交流，如临床数据和动物实验不相符的时候，免疫细胞亚群改变，遗传毒性体外和体内实验数据相互冲突时等等，姜博一一进行了详细的讨论，大家纷纷的表示收获很多。
李博士的分享包含生物标记物的应用价值和基本概念，生物标记物的开发路径，生物标志物的应用和伴随诊断以及实际案例介绍。李博士首先从药物临床研发成果的数据，直观的介绍了生物标志物的应用对临床试验成功率大幅提高的贡献（如图一所示）。
图一
李博以易瑞沙20多年曲折的临床试验过程，阐述了在临床试验或者在临床前进行生物标记物的探索的必要性。随后，李博提到Biomarker的分类包含Susceptibility/risk biomarker, Diagnostic biomarker, Monitoring biomarker, Prognostic biomarker, Predictive biomarker, Pharmacodynamic/response biomarker, Safety biomarker 七大类，并且应用贯穿临床过程的各个环节以及新药研发的整个过程。生物标志物的开发流程分为Discovery, Analytical, Clinical qualification和Utilization四个步骤。李博士以大量的实际案例，展开介绍生物标志物不同开发过程的方法和注意事项。通过李博的分享，听众们对生物标志物的开发有了更加系统和深刻的认识。
最后，李博重点介绍伴随诊断试剂开发，目前常见的是同步（Co-development）、桥接（Bridging）、跟随（Follow on）三种模式，FAD比较鼓励同步的开发模式。李博还和大家一起共同讨论了中美在伴随诊断发展的异同点，为我国后续伴随诊断的发展提供一些参考和启发。在提问阶段，有听众提出met skipping &lification, 选择少基因数的大panel size还是多基因数的小panel size 更优? 李博回复不管是大panel还是小panel，如果他们的检测性能，覆盖区域都是一样的话，都可以选。然后结合预算，检测量，是否有探索性需求，是否要做伴随诊断等等，再做评估。panel大小并不是最重要的。对于检测能力的评估，以及上述几个方是需要综合考虑。
茶歇之后，熙宁生物的高级技术总监朱国振嘉宾带来基于流式细胞术的大分子受体占位研究的分享，朱先生的分享包括受体占位实验的检测模式，双特异性抗体检测的特殊考量以及受体占位经验分享。
在正式分享之前，朱先生首先提出两个流式细胞术检测受体占位常见的问题：（1）检测给药前的受体占位是30%，而给药后检测是150%，与理论上给药前受体占位0%，给药后占位小于100%不符 （2）遇到样本不稳定的情况怎么处理？听众们纷纷表示对朱先生提出的问题感同身受。接下来，朱先生分别介绍了游离受体检测，结合受体检测，总受体检测的常见方法以及每种方法的优缺点。朱先生详细总结了不同研发阶段常用的检测模式，对大家日常的工作有很大的帮助。
关于动物或者临床试验中，受体占位比例（%RO）的计算，以及一个样品需要多少个检测管，朱先生介绍了7个常用的公式，并列出不同的公式对应的检测管数目，同时结合实际案例和大家一起探讨每个公式的计算结果。对于双特异性抗体受体占位检测方法与策略，朱先生介绍了两种常见双抗的检测方法：1 一个靶点在细胞膜上，一个是游离的（PD-L1/TGFβ）；2 两个靶点都在细胞膜上（PD-L1/4-1BB）。朱先生强调，在抗体药发现过程中，其他候选抗体建议保留，可能在PD检测中非常有用，尤其是非竞争性抗体在双抗PD检测中的用途。多数企业临床前有相关的抗体，但是负责临床的同事不知道，造成资源的严重浪费。
朱先生以丰富的实际经验，和大家分享冻存全血，分离并冻存的PBMC，新鲜全血的样本稳定性以及在受体占位检测中的应用。大家关于受体占位检测的实验方法和朱先生进行了热烈的讨论，朱先生一一解答了大家日常工作中经常遇到的问题。
04
生物药的免疫原性（包括ADA）
10月24号下午，上海益诺思高级总监陈博带来《生物药的免疫原性(包括ADA)》，陈博以自己做slide时的想法开场，营造了轻松愉快的气氛，紧接着，陈博阐述了免疫原性产生机理，解析数据背后的story，抗体免疫原性的产生需要先激活innate immune（Dendritic cells, monocytes, Granulocytes, NK cells etc.），然后通过DC 抗原递呈激活adaptive immune，包括T helper cells 和 cytotoxic T cells，T helper cells 激活B cells 产生抗体，从而产生ADA。很多in vitro assay，也是基于这个原理设计的。关于免疫耐受，有不同的产生机理，比如缺乏共刺激信号，Tregs 抑制调节，凋亡信号，还有特殊部位（如眼睛，缺乏免疫系统，是很多药物愿意做眼部研究的一个原因），对低水平内源性蛋白质的免疫耐受是不完整的。同时，陈博分享了Primary and secondary immune response机制，关于这点大家进行了很多的交流。Immunogenicity-not the end of world，陈博强调说，我们要了解哪些是我们想要的免疫原性，哪些是不想要的免疫原性，对于不想要的免疫原性，陈博举例说明，其中，诱导抗药物抗体与内源性对应物发生交叉反应是需要非常关注的，对于hypersensitivity，有四种类型，IgE介导的hypersensitivity，如过敏反应，这个也是非常严重的。
茶歇后，陈博带来第二部分Assay Development and validation （方法的开发与验证），陈博介绍了ADA, Nab以及cytokine的方法开发与验证。对于ADA方法开发，陈博重点介绍了cut point的筛选和验证、增加drug tolerance 的方法以及应对靶点干扰的方法。在Nab 抗体检测方法中，陈博和大家一起详细对比Nab assay 和 Potency Assay的不同，帮助大家对Nab assay有了更全面的了解。陈博结合PD-L1抗体的案例，和大家分享了Cell base assay 和Non cell based competitive ligand binding assays的开发过程。关于Cytokine Release assay（CRA）, 陈博介绍了常用的soluble phase CRA和 Solid phase CRA以及数据的评估和解读。陈博提到，对于Assay中的离群值去除和cut off 的计算没有统一的规则，需要具体的分析。随着mRNA疫苗的大规模使用和CAR-T产品国内获批，cell and gene therapy也是非常重要的发展趋势之一，那对于cell and gene therapy产生ADA的机理是不一样的，其中非常重要的是CD8的apoptosis and necrosis。关于临床前免疫原性检测，虽然目前免疫原性知道原则更关注临床试验的研究，而且临床前ADA的研究并不能预测临床阶段病人的免疫原性，但是目前还是有越来越多的新药研发会做临床前ADA检测。陈博和大家分享了一个4周每天重复给药的食蟹猴实验的案例，结果显示低剂量和高剂量ADA滴度水平类似，中剂量给药ADA滴度最高，数据还显示ADA对药物暴露、受体占位以及动物体重均产生了明显的影响。陈博强调我们不仅要做好assay，也要了解数据背后的机理，和大家从另一个角度看生物药的免疫原性，这给大家带来深刻的印象。
精彩瞬间
至此，为期两天的抗体药研发Workshop模块四《抗体药物生物分析与临床前安全性评价》圆满结束。感谢各位嘉宾以及同学们的喜欢和支持!
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