综合单细胞转录组分析揭示食管鳞状细胞癌微环境的异质性
肿瘤微环境是一个高度复杂的生态系统，它塑造了癌症生物学并影响了对治疗的反应。食管鳞状细胞癌(ESCC)是一种常见的（每年>40万例）和高侵袭性（每年导致约30万人死亡）的恶性肿瘤；ESCC患者的5年生存率低于20%。最近，免疫检查点封锁治疗对ESCC患者显示出一定的疗效。然而，与大多数实体肿瘤一样，只有约20-30%的ESCC患者受益于抗pd-1治疗。免疫检查点阻断治疗的疗效差异与肿瘤的免疫细胞的异质性有关。显然，更好地理解ESCC肿瘤微环境的免疫景观将帮助我们了解肿瘤细胞的增长和发育过程，且能够为抗免疫治疗耐药性提供新思路。在ESCC中，细胞异质性的程度、不同生物状态的动态以及它们对肿瘤生态系统的功能影响仍不明确。
对来自11例ESCC患者对应的血液、肿瘤及癌旁样本进行单细胞转录组测序，分析了ESCC的肿瘤微环境。进而对癌旁和肿瘤样本中的成纤维细胞的多样性进行分析，确定了7个亚簇。并在对ESCC中确认激活肌成纤维细胞亚群的特定标记物，在肿瘤和癌旁样本之间进行差异分析。对ESCC中的免疫细胞的多样性及活化轨迹进行分析，最后采用免疫荧光染色验证细胞类型。
单细胞测序实验流程示意图
1、ESCC及癌旁食管组织的细胞微环境
对11例未治疗的ESCC患者的原发肿瘤和癌旁组织以及3例患者的外周血单个核细胞(PBMCs)进行了scRNA-测序。经检测共聚类得到8个亚群共62161个细胞，其中，ESCC肿瘤中共获得21355个细胞，癌旁组织中共获得19882个细胞，PBMC样本中获得20924个细胞，包括上皮细胞（包括非恶性食管上皮细胞和肿瘤细胞，称为上皮/肿瘤细胞）、免疫细胞(髓系细胞、肥大细胞、T细胞和B细胞)、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。（图1）
图1 食道鳞状细胞癌(ESCC)的单细胞转录组图
2、ESCC中的成纤维细胞的异质性
从癌旁和肿瘤样本中，作者检测到共12126个成纤维细胞，为了探究ESCC中的成纤维细胞的多样性，对癌旁和肿瘤样本中的成纤维细胞进行分析，聚类到了7个簇。图2B显示，除F_3亚群在肿瘤中显著富集外，其他所有亚群在肿瘤和癌旁样本中富集程度没有显著差异。图2E表示对7个亚簇进行GO富集分析，结果显示，在F_3亚群中，富集最显著的是“胶原纤维组织”“ECM组织”和“内胚层细胞分化”。成纤维细胞最重要的功能之一是通过分泌分子重塑ECM来塑造组织结构，包括胶原、基质金属蛋白酶、层粘连蛋白、骨膜蛋白等。因此，这些结果表明在ESCC中不同的成纤维细胞亚群的功能特化。（图2）
图2 ESCC的成纤维细胞异质性
3、肿瘤特异性CST1+肌纤维母细胞与ESCC预后不良相关
在TCGA等大批量表达数据集的ESCC队列中，与癌旁组织样本相比，肿瘤中的F_3基因表达明显更高。接下来，作者旨在在ESCC中确认这一激活肌成纤维细胞亚群的特定标记物，在肿瘤和癌旁之间进行了差异表达分析。在F_3簇内，确定CST1为最高的癌特异性基因。此外，与其他成纤维细胞亚群相比，CST1也是F_3中表达差异最大的10个基因之一。在前述聚类到的8种细胞类型中，CST1只在成纤维细胞的F_3亚群特异性表达。接下来，在16例肿瘤和16例匹配的癌旁食管样本中使用针对CST1和COL1A1的特异性抗体进行免疫荧光(IF)双染色。发现CST1蛋白在肿瘤样本中COL1A1+成纤维细胞亚群中表达，但在癌旁中几乎检测不到。在另外9例癌旁/肿瘤配对的ESCC病例中，免疫组化(IHC)结果证实了肿瘤相关成纤维细胞间质中显著表达CST1蛋白(11.95%)，而在相邻的癌旁食道中没有表达。之后作者证实了CST1+肌成纤维细胞普遍存在于ESCC患者肿瘤间质中。发现，CST1+肌成纤维细胞的丰度较高与较短的总生存期(P = 0.0051)和无病生存期(P = 0.014)密切相关。CST1表达的预后价值在另一组ESCC患者中通过大量表达数据得到验证(P = 0.039)。这些数据共同强调了CST1+肌成纤维细胞在ESCC中的预后价值，并表明其潜在的生物学意义。为了探索CST1+肌成纤维细胞在其他类型癌症中是否存在，我们重新分析了含有成纤维细胞的单细胞转录组的公共数据。事实上，我们观察到CST1在肺癌、结肠癌和头颈部癌成纤维细胞亚群中的表达频率相当(1.22－3.61%)。此外，与我们在ESCC中得到的数据一致，CST1+成纤维细胞仅在这些癌症类型的肿瘤样本中被检测到，再次证实了它们的肿瘤特异性。（图3）
图3 CST1+肌成纤维细胞在ESCC中具有肿瘤特异性，并预测生存结果
4、ESCC的抗原呈递成纤维细胞(ap-Fibro)
F_2亚群表现出抗原加工和呈递以及干扰素γ信号通路的特异性富集。且F_2中所有TOP差异表达的基因都属于MHC II类(如HLA-DRA, CD74, HLA-DRB1, HLA-DPB1)。Ap-Fibro也表达成纤维细胞标记物(DCN, VIM, FSP1)，与其他成纤维细胞亚群表达水平相似，证实它们也具有成纤维细胞的特征。为了证实Ap-Fibro在ESCC组织中的存在，对16例ESCC患者的肿瘤和癌旁样本进行了IF双染色。结果发现HLA-DR被证实在VIM+细胞的一个亚群中表达。此外，IF染色检测HLA-DR+成纤维细胞的比例(在良性样本中为5.87%，在肿瘤样本中为6.53%)与scRNA-Seq检测的结果相当(在良性样本中为2.2%，在肿瘤中为3.0%)。（图4）
图4 ESCC中的抗原呈递成纤维细胞
5、ESCC的免疫细胞微环境
作者从癌旁和肿瘤样本中分别鉴定了总计10,131和7,792个免疫细胞，对癌旁和肿瘤样本中的免疫细胞进行检测，结果显示，肿瘤和癌旁样本中均有T细胞和NK细胞、髓系细胞和肥大细胞、B细胞和浆细胞。在大多数患者的肿瘤和癌旁样本中进一步聚类分析T细胞和粒细胞识别，聚类到了四个CD4+T和两个CD8+T细胞亚群，八个单核细胞/巨噬细胞亚群，和六个树突细胞(DC)的亚群。除了调节T细胞(Treg）外，我们还发现了三个CD4+T细胞亚群。在CD4+T细胞的其他三个亚群中，CD4_1表达了滤泡辅助T(TFH)效应因子(CXCL13、IL2RA、TNFRSF18、TNFRSF等基因)。CD4_2亚群表现出效应记忆基因特征，包括IL7R、CXCR6和Galectin-3(由LGALS3编码)，且在癌旁样本中更为丰富。值得注意的是，不同的CD4+T细胞亚群在ESCC肿瘤中表达不同的免疫检查点，CD4_1在肿瘤中表达上调的TIGIT, CD4_2仅在肿瘤中表达PD-1(由PDCD1编码)，CD4_3表达肿瘤特异性的TIGIT和CD96。此外，CD4_1和CD4_2在肿瘤CTLA-4的含量均表达较高。来自肿瘤样本的CD8+T细胞亚群均比癌旁样本表达更高的效应基因，包括趋化因子(如CCL5)、细胞毒性相关基因(如PRF1、GZMA、GZMB、GZMH)和促炎细胞因子(如IL-32)。两个簇也表现出癌症特异性，其特征是检查点分子(CTLA-4, LAG3, TIGIT)的高表达。此外，CD8_1和CD8_2在肿瘤样本中PD-1和CD96的水平都有所增加。这些表示在ESCC肿瘤微环境中，CD8效应T细胞的功能受到共抑制因子的抑制。比较两个CD8+T细胞亚群显示出不同的基因特征，CD8_1细胞标记物的表达含量更高，包括CCL5、CXCR4、CXCR6、PRF1、GZMB、GZMH、GZMA，而CD8_2在肿瘤样本中高表达多个热休克蛋白(HSPA1B、HSPA6、HSPA1A)。为了探索髓系细胞（树突细胞、单核细胞、巨噬细胞)和T细胞之间的细胞-细胞相互作用，在ESCC肿瘤和癌旁样本中应用CellPhoneDB。结果发现，肿瘤中髓系细胞和T细胞之间相互作用的程度明显高于癌旁样本。此外，还发现关键的免疫检查点抑制剂及其配体如PD1-PDL1 (CD274)和CTLA4-CD80/86在肿瘤中的相互作用得分高于正常样本，这与我们之前观察到的，肿瘤样本中的CD4+T和CD8+T细胞数量都更丰富这一结论是一致的。（图5）
图5 ESCC的髓细胞和T细胞图
6、ESCC的髓细胞多样性和活化轨迹
经典树突细胞(cDCs)分为cDC1和cDC2两个亚群，其主要功能是获得肿瘤抗原，迁移到淋巴结，并分别启动CD8+T和CD4+T细胞。在ESCC微环境中，DCs具有明显的多样性，并聚集成5个cDC亚群和一个表达LILRA4和IRF7的浆状树突细胞(pDC)亚群。在这些簇中，DC_1亚群表达经典的cDC1标记基因CLEC9A、XCR1、IRF8、BATF3，而DC_5高表达经典cDC2标记基因FCER1A、CD1C。在单核细胞中，我们发现了2个经典的CD14+单核细胞亚群Mon_1和Mon_3，它们表达常规的单核细胞基因，如VCAN、THBS1和CD300E。我们的结果表示，S100A8/9的表达在肺癌的单核细胞亚群中受到限制，另一个单核细胞亚群Mon_2表达SERPINB1。SERPINB1是一种由中性粒细胞和单核细胞产生的细胞质丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以抑制炎症和组织损伤。在ESCC的5个巨噬细胞亚群中，Mac_1、Mac_2和Mac_3表达了较高的抗炎M2型相关基因，包括CCL18、MRC1、CD163、C1QA、APOE、SPP1和TREM2。Mac_3表达了许多非经典单核细胞基因，如热休克蛋白。Mac_5的特征是特异性表达干扰素刺激基因如ISG15、OASL、IFIT2/3。这表明Mac_5可能代表了干扰素信号通路激活的促炎巨噬细胞。与其他巨噬细胞亚群相比，Mac_5表达的M2型基因最低。血液、癌旁和肿瘤样本之间的T细胞簇，表明免疫细胞与组织调节的相关性。然后我们进行扩散成分分析，以确定与观察到的细胞状态变化相关的基因表达模式。聚焦于骨髓腔室，显示出三个主要的扩散成分。循环单核细胞基因(FCN1, S100A4/8/9/12, CD52)与第一扩散成分呈负相关，而巨噬细胞中丰富的基因(如HLA-DR基因和CD74)与第一扩散组分呈正相关。第二个扩散成分的特征是激活的巨噬细胞基因，如APOE, C1Q(s)和IL1B，这可能反映了组织中单核细胞来源的巨噬细胞的激活，类似于乳腺癌和头颈癌中的巨噬细胞激活途径。第三个扩散组分与DC相关标记物FCER1G和FTL以及DC中上调的基因如CST7和DAPP1相关。这些分析共同表明，ESCC微环境中不同的髓细胞轨迹和分化背后有重要的转录程序。（图6）
图6 ESCC中髓腔室的细胞异质性
7、多重IF染色验证候选细胞亚群
接下来，进行了多重6色免疫荧光染色，以表征候选免疫抑制免疫细胞（包括巨噬细胞和Treg）、CD8+T细胞以及CST1+成纤维细胞之间的丰度和定位。作者使用以下两组抗体组合进行多重IF测定：Panel-1由αSMA+CST1（用于CST1+成纤维细胞）、CD8+CTLA4（用于 exhaustive CD8+T细胞）、CD163（用于 M2-样巨噬细胞）。Panel-2由αSMA+CST1、CD4+FOXP3 (Treg细胞)、CD163组成。选择了αSMA而不是COL1A1来进一步验证CST1+成纤维细胞的存在。验证了良性肿瘤中CST1+成纤维细胞含量的降低，exhaustive CD8+T细胞、Treg细胞(图7E)以及M2-样巨噬细胞数量的增加。此外，在肿瘤样本中，M2-样巨噬细胞的丰度与exhaustive CD8+T细胞丰度显著相关，表明M2-样巨噬细胞对CD8+T细胞具有负调节作用。此外，观察到肿瘤样本中CST1+成纤维细胞和Treg细胞之间呈适度正相关关系。(图7)
图7 IF染色验证候选细胞亚群
本研究揭示了ESCC中大多数细胞类型的显著异质性，特别是免疫细胞(骨髓细胞和T细胞)和成纤维细胞。通过发现的亚群(例如，表达热休克蛋白的CD8+T细胞，分泌组织蛋白酶的巨噬细胞)和特定的标记物(例如肌成纤维细胞的CST1)，该数据集为未来研究癌症生态系统的细胞多样性提供了思路。进一步，从ESCC间质细胞中识别出许多肿瘤特异性信号和通路(如T细胞和巨噬细胞中的抑制检查点，肌成纤维细胞中的EMT和TGF-β通路)，提示间质细胞转录程序的癌特异性调控。
CST1+肌成纤维细胞的一个特定群体在ECM重构、蛋白分泌、EMT和TGF-beta通路中具有高活性。CellPhoneDB分析显示，肿瘤中与CST1+成纤维细胞有关的配体-受体相互作用的数量通常比癌旁样本中高得多。使用免疫染色等正交方法，证实了CST1+肌成纤维细胞在ESCC肿瘤间质的存在，并表现出显著的预后价值。此外，CST1+肌成纤维细胞在其他类型的癌症中也可以观察到，但在癌旁样本中却没有。
总的来说，对骨髓和淋巴细胞的分析突出了ESCC微环境的免疫抑制特性: i) CD4+T和CD8+T细胞都以肿瘤特异性的方式表达各种免疫检查点; ii)肿瘤样本中Treg细胞更丰富; iii) M2型巨噬细胞(Mac_1、Mac_2、Mac_3亚群)表达抗炎因子，甚至M1型亚群(Mac_5)在肿瘤标本中特异性表达PD-L1; iv)不同的单核细胞亚群表达免疫调节因子和促肿瘤因子。
最后，食管癌间质中癌特异性基因表达的改变可能对免疫疗法的设计具有一定的指示作用。例如，肿瘤巨噬细胞增加抑制检查点分子的表达，而肌成纤维细胞上调氧化磷酸化和糖酵解途径，可以使用小分子靶向抑制剂。此外，CD8+T细胞的检测支持PD-1和CTLA-4的免疫检查点，并进一步确定了LAG3, TIGIT等抑制分子可以作为潜在靶点。因此，肿瘤间质独特的生物学特性可能表明癌症具有一定的特异性，并为创新疗法的发展提供了新的思路。
[1] Dinh, H.Q., Pan, F., Wang, G. et al. Integrated single-cell transcriptome analysis reveals heterogeneity of esophageal squamous cell carcinoma microenvironment. Nat Commun 12, 7335 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-27599-5.
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