异细胞OSM-OSMR信号转导成纤维细胞促进胰腺癌生长和转移

研究背景

胰腺导管腺癌(PDA)的特征是广泛结缔组织增生反应，占肿瘤体积的85%左右。突变的肿瘤细胞嵌入在一个坚硬的细胞外基质(ECM)中，它与基质宿主细胞共存。异常调节的免疫细胞和癌症相关成纤维细胞(CAFs)是整个PDA发展过程中必定发生的。CD4⁺调节性T细胞、髓系来源的抑制细胞和巨噬细胞(MØs)在PDA发育早期浸润，通过基质金属蛋白酶(MMP)和IL6信号通路直接促进肿瘤进展，同时抑制抗肿瘤免疫。然而，离散间质群体协调调节特定肿瘤功能的机制仍未完全确定。因此，确定动态调节的CAF亚群、免疫浸润和肿瘤细胞功能之间的功能相互依赖性对于确定基质靶向策略仍然是至关重要的。

研究方法

利用单培养和共培养成纤维细胞的批量RNA测序，探索了肿瘤细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的异细胞相互作用对PDA病理生物学的影响，并通过植入OSM缺陷(Osm^−/−)小鼠的肿瘤细胞，体内实验验证巨噬细胞-肿瘤细胞的相互作用是通过OSM-OSMR信号通路诱导炎性成纤维细胞，从而在体内促进肿瘤生长和转移。

方法与流程示意图

研究结果

1、OSMR的表达与肿瘤促进性炎症和PDA的不良预后相关

为了识别和表征可能调节CAF功能的新基质受体和配体，分析了小鼠和人类PDA的RNA-seq数据。对iCAF和myCAF亚群的差异基因表达分析发现了一些膜受体，如OSMR、Antxr1和Il1r1，它们在iCAF中表达水平更高(图1a)。单细胞测序证实了OSNR、Antxr1和Il1r1在CAFs以及人和小鼠PDA的内皮细胞和血管周围细胞中均有表达。此外，与myCAFs和apCAFs相比，这些受体在iCAFs中的表达水平更高(图1b，c）。为了进一步分析OSMR在人切除的PDA中的表达，使用多路原位mRNA杂交OSMR，免疫荧光检测波形蛋白（标记基质）和泛细胞角蛋白（标记上皮细胞）（图1d)。与scRNA-seq数据一致，OSMR在VIM^pos肿瘤间质中广泛表达。为了确定OSMR、ANTX1和IL1R1的表达是否与患者预后相关，我们研究了它们与患者生存的关系。对正常组织样本(GTEx)和人PDA肿瘤(TCGA PanCancer PAAD)的分析显示，与正常胰腺组织相比，人PDA中OSMR及其同源配体(OSM)的表达水平显著升高(图1e)。此外，在分析的三种富含iCAF的受体中，OSMR是唯一一种表达与PDA患者的预后差相关的受体，其中，OSMRmRNA表达水平较高的PDA患者比OSMR表达水平较低的患者表现出更差的生存率(图1f)。进一步在体内研究OSMR表达和iCAF表型之间的关系，我们使用KPC27和KPP33肿瘤公共scRNAseq数据集，比较了OSMR^pos和OSMR^neg CAFs中炎症介质的表达，表明Il6，Ccl2，Ccl7Ccl7和Cxcl1CAFs的表达升高(图1g)。OSM在小鼠和人PDA的MØs和髓系细胞，以及小鼠中性粒细胞和树突状细胞中均有表达(图1h)。这些数据表明髓系/MØ-secreted OSM可能以旁分泌的方式作用于表达OMSR的间充质细胞，如成纤维细胞。为了验证这一假设，对人类和小鼠PDA的scRNA-seq公共数据集进行CellPhoneDB分析，并评估MØ-成纤维细胞配体-受体相互作用。该分析进一步强调OSM-OSMR是在人和小鼠PDA中保守的基质旁分泌信号(图1i）。

图1 在PDA中，OSMR表达与促肿瘤炎症和预后不良相关

2、MØ-肿瘤细胞相互作用诱导体外炎性成纤维细胞

为了进一步分析异细胞OSM的OSMR信号，首先确定胰腺星状细胞(PSCs)、PCCs和MØs体外共培养是否会增加炎症介质的产生。因此，通过LUMINEX定量培养基中30种可溶性炎症信号的丰度，这些培养基来自单核细胞和共培养的PSCs和MØs(图2a)。此外，尽管培养的细胞总数相同，3-way (3W)共培养的PCS、PSCs和MØs导致信号变化，22种细胞因子和趋化因子的丰度进一步增加(图2a）。大多数转录本以细胞类型特异性的方式表达和调控。然而，Ccl2和Ccl7在3W共培养的PSCs中也有表达PCS和MØs。mRNA水平的层次聚类和主成分分析(PCA)表明，PSCs根据特定的异细胞相互作用，参与了离散的分泌过程。相比之下，PCC、PSC 2W共培养的PSCs(这里称为2wPSCs)表现出明显的分泌模式，并且Cxcl12、Tgfb2和Ccl11的表达增加(图2b）。配体在从单培养和共培养中分离出来的PCCs或MØs中没有差异基因表达(图2b)，这表明PSCs对局部细胞环境的变化特别敏感。基因表达分析发现，在2和3W共培养的PSCs中，存在1758个差异调控基因。2W-PSCs显示编码ECM蛋白的基因表达增加，包括胶原Col6a1, Col11a1, Col4a5, Col4a6和Acta2 (α-平滑肌肌动蛋白，αSMA)，这是肌成纤维细胞的一个明确的marker(图2c)。在3W-PSCs中大量表达，证实成纤维细胞是炎症信号的主要细胞来源(图2c）。同样，许多炎症信号是在3W共培养的培养基中识别出来的(图2a），在3W-PSCs中大量表达，证实成纤维细胞是炎症信号的主要细胞来源(图2c)。例如，3W-PSCs中上调的基因包括cc趋化因子(Ccl2、Ccl7和Ccl5)、JAK-STAT (OSMR、Jak2和Stat3)和NFκB (Chuk、Nfkb1和Relb)通路成分，以及NFκB靶基因如C1s、Vcan、Has2、Mt2和Il4ra(图2c）。基因组富集分析(GSEA)显示，3W共培养与PSCs中通过NFκB通路和IL6-JAK-STAT通路富集炎症信号通路、TNFα信号通路相关，而2W-PSCs中上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)和氧化磷酸化通路富集(图2d)。这些结果与之前描述的PDA中的iCAF亚群一致，表明异细胞相互作用影响成纤维细胞亚型。为了确定具有不同PCC的2W和3W共培养物的 PSC亚型转换是否一致，我们使用三种不同的PCC从2W PCC PSC 和3W PCC PSC MØ 共培养物中收集了条件培养基，并分析了选定的表达用条件培养基刺激的PSC中的炎症（Il6、Il4ra 和 Cxcl1）和肌成纤维细胞（Acta2）标志物(图2e)。事实上，2W和3W PSCs在所有PCC中显示了与亚型切换一致的转录变化(图2e，左)。尽管Acta2在所有2W条件下都表达得更高，但3W条件培养基增加了炎症基因的表达，减少了Acta2(图2e，右)。此外，为了评估PSC亚型转换是否特异性于3W共培养条件，而不是由于PSC和MØs之间的直接相互作用，我们比较了2W和3W共培养条件下PSC、PSCs和MØs的基因表达。这一数据证实，只有在三种细胞类型均存在的情况下，PSCs才会降低Acta2的表达，增加Il6、Il4ra和Cxcl1的表达(图2f)。为了证实MØs的作用，建立了MØ-limiting滴定实验，在3W共培养中减少MØs的数量，并通过MC定量了间充质细胞标志物的表达(图2h)。这表明在3W共培养中，随着MØs数量的减少，优先在3W-PSCs中表达的标记物，如PDPN、CD73和Integrin α5减少(图2h)。

图2 巨噬细胞-肿瘤细胞的相互作用诱导炎性成纤维细胞3、异细胞OSM-OSMR信号通路诱导炎性成纤维细胞OSM和OSMR在体外有差异表达，其中MØs表达OSM, PSCs表达OSMR(图3a)。因此，我们假设异细胞OSM-OSMR信号通路诱导PSCs中炎症介质的表达。为了验证这一假设，我们分析了用重组OSM或单培养和共培养的PSCs、PSCs和MØs处理的PSCs中选定的肌成纤维细胞和炎症标志物的表达(图3b)。因此，我们假设异细胞OSM-OSMR信号通路诱导PSCs中炎症介质的表达。为了验证这一假设，作者分析了用重组OSM或单培养和共培养的PSCs、PSCs和MØs处理的PSCs中选定的肌成纤维细胞和炎症标志物的表达(图3b)。重组OSM和3W共培养条件培养基诱导PSCs的转录转移，不同于单独和2W PCC PSC共培养，如PCA所示(图3b左)。具体来说，重组OSM增加了炎症介质的表达，包括Il6、Il4ra Cxcl1、Mt2、Nos2和Vcan(图3b右)。同样，与PCC共培养的PSCs中主要表达的标记物，如Thbs1、Col4a5、Col4a6、Acta2和Ccnd1，在OSM刺激后减少(图3b右)。为了进一步阐明MØ-诱导的PSCs炎症基因表达的分子依赖性，作者在PCC PSC MØ 3W共培养条件的培养基中加入OSM阻断或控制抗体，并评估对PSC基因表达的影响，正如预期的，抑制JAK2和IKKβ可以减少炎症介质的表达，同时增加肌成纤维细胞基因的表达。这导致了一种更类似于2W-PSCs的转录状态，同样，在3W条件培养液中加入OSM阻断抗体也能诱导PSCs的转录转移，其标志是炎症介质的表达减少，肌成纤维细胞基因的表达增加。OSM阻断抗体以及JAK-STAT和NFκB通路抑制剂的作用通过CRISPR Cas9介导的PSCs中OSMR敲除进行了复制(图3c)，证实了OSM-OSMR信号通路在PSCs中诱导炎症基因表达中的作用。图3 异细胞OSM-OSMR信号通路诱导炎性成纤维细胞

4、肿瘤细胞分泌的GM-CSF增加了OSM的MØ分泌

为了识别可能的OSM诱导信号，用PCC条件培养基处理MØs，并通过ELISA检测条件培养基中的OSM水平(图4a)。在单培养条件下，所有PCC细胞株均未产生OSM，但是，在条件培养基中，MØs的OSM水平均有所提高(图4a)。此外，在强烈诱导OSM的PCC条件培养液中，GM-CSF水平普遍升高(图4b)。当将GM-CSF中和抗体加入PCC条件培养液和重组GM-CSF后，MØs的OSM分泌被阻断(图4c)，证实了PCC产生的GM-CSF是OSM分泌的关键调节因子。然后作者试图确定GM-CSF是否可以替代3W共培养的PSC，诱导PSC中炎症信号的表达，并将重组GM-CSF加入到PSC MØ共培养物中，用条件培养液刺激PSC。重组GM-CSF PSC MØ培养物诱导PSC中OSMR和炎症基因的表达(图4d)。这些数据表明GM-CSF在MØs中诱导OSM表达的作用，从而使MØ-induced炎症基因在成纤维细胞中表达。最后，对TCGA PanCancer PAAD数据集的分析发现，在PDA患者中，OSM表达水平和CSF2(编码GM-CSF)表达呈正相关(图4e)，强调了PDA中GM-CSF和OSM表达之间的临床相关性。总的来说，这些发现表明GM-CSF是MØ OSM分泌的积极调节因子。图4 肿瘤细胞分泌的GM-CSF增加巨噬细胞分泌OSM

5、OSM支持免疫抑制微环境的形成

接下来，作者试图确定OSM在体内的作用，并分析了PCCs原位植入同基因野生型或OSM缺失的C57BL/6小鼠(Osm^−/−)的肿瘤微环境(图5a)。首先，我们量化了PDA中一些已知的炎性细胞因子对肿瘤的促进作用。来自Osm^−/−/动物的肿瘤显示出几种细胞因子水平显著降低，包括IL6、CXCL1、GM-CSF和TNFα，突出了肿瘤环境的变化(图5b)。对典型的myCAF标记物αSMA (Acta2)的免疫组化(IHC)分析显示，与野生型动物相比，Osm^−/−/动物中αSMApos区域增加(图5c)。然而，在野生型或Osm^−/−/动物中生长的肿瘤中，经小红染色测定的纤维性胶原蛋白没有显著差异(补充图5a)。FACS分析显示在野生型和Osm^−/−/肿瘤中CAF浸润水平相似(图5d右)，这表明改变的αSMA染色是由于从iCAFs到myCAFs的表型转换。基因表达分析进一步证实了这一点，从Osm^−/−/肿瘤中分离的CAFs显示炎症基因表达下降(如Il6、Mmp3、Has2和OSMR)，但肌成纤维细胞基因表达增加(如Acta2、Itgav和Fn1)(图5d左)。总之，这些结果证明了OSM在建立PDA特有的炎症微环境中的作用。

图5 OSM支持免疫抑制微环境的形成

6、 PCC-PSC-MØ相互作用重塑肿瘤细胞信号传导

鉴于PCC PSC和PCC PSC MØ共培养细胞之间的细胞信号环境发生了变化(图2a)，我们假设在这两种条件下，肿瘤细胞的信号和功能受到不同的调节。因此，我们对基质调节的肿瘤细胞信号进行了定量磷酸化蛋白质组学分析，用单培养的PCC和2W PCC PSC或3W PCC PSC MØ共培养的条件培养液处理肿瘤细胞(图6a)。磷酸化网络分析进一步强调MAPK1/3和AKT是调节PCC PSC MØ-induced肿瘤细胞信号的中枢激酶。Shc1激活的SRC和gp130激活的JAK2信号均增加了STAT3的磷酸化，这是胰腺癌进展的关键步骤。此外，PCC-PSC-MØ信号通路独特地导致p38和JNK通路组分包括TAOK1和MAP2K7 (MKK7)的磷酸化(图6b)。此外，在所有单培养和共培养条件下，用条件培养基处理的PCC中磷酸化的STAT3的免疫印迹显示，只有在PCC PSC MØ条件培养基中，磷酸化的STAT3特异性增加(图6c)。这种作用不太可能是OSM对PSCs的直接作用，因为重组OSM仅参与PSCs中STAT3的磷酸化。此外，3W共培养诱导的PSCs中STAT3磷酸化依赖于PSCs中OSMR的表达，其中CRISPR Cas9介导的PSCs中OSMR敲除可诱导PSCs中STAT3磷酸化(图6d)。这些数据强调了肿瘤细胞、成纤维细胞和巨噬细胞之间相互作用的重要性。PDA肿瘤单样本GSEA (ssGSEA)经肿瘤纯度调整，证实了有差异信号通路的参与，其中OSMR^lhigh肿瘤显示KRAS通路活性增加，PI3K-AKT-mTOR和IL6-JAK-STAT3信号通路活性增加。ssGSEA还在OSMR^lhigh肿瘤中发现了EMT特征基因的富集(图6e)。为了进一步验证这一观察结果，作者分析了用来自2W和3W共培养条件培养液处理的PCC，结果显示，在3W共培养条件培养液处理的PCC中，E-Cadherin水平降低，VIM和SNAIL/SLUG增加(图6f)。因此，肿瘤细胞、成纤维细胞和MØs之间的相互作用，通过OSM-OSMR信号通路，诱导炎性成纤维细胞表型，进而参与迁移和间充质肿瘤细胞信号通路。

图6 PCC-PSC-MØ相互作用重塑癌细胞信号

7、 OSM在体内促进肿瘤生长和转移

正如预期的那样，通过iRFP信号强度、原发肿瘤体积和肿瘤重量来定量，将肿瘤细胞注射到野生型动物的胰腺中可以有效地建立原发肿瘤(图7a)。相比之下，将相同的细胞注射到Osm^−/−小鼠体内后，iRFP强度、肿瘤体积和肿瘤重量显示，肿瘤负荷显著降低，显示了OSM在原发肿瘤生长中的全身作用。免疫组化分析证实，Osm^−/−/肿瘤中的PanCK^pos组织面积减少，表明肿瘤生长受到抑制(图7b)。增殖标志物Ki67染色无显著差异，但野生型动物肿瘤中cleaved caspase 3水平升高(图7c)。PanCK^pos肿瘤细胞的定量形态学分析显示，野生型动物的间叶和上皮混合表型向Osm^−/−/动物的上皮主导表型转变(图7b)。免疫组化对EMT标记物SLUG的染色显示，Osm^−/−/动物肿瘤中SLUG水平下降，但SNAIL水平无显著差异(图7c)。虽然超过50%的野生型动物发生了iRFP+肝转移，但没有一个Osm^−/−动物显示出任何肝转移的迹象(图7d)，这表明OSM在调节转移性扩散中的作用。值得注意的是，CD31染色并没有显示野生型或Osm^−/−动物肿瘤之间血管丰度的明显差异(图7c)。综上所述，这些发现强调了OSM是建立炎症微环境促进肿瘤生长和转移的关键MØ-derived信号。

图7 OSM在体内促进肿瘤生长和转移

结论

在这项工作中，作者研究了肿瘤细胞、成纤维细胞和MØs的异细胞相互作用对PDA病理生物学的影响。我们观察到肿瘤细胞衍生的粒细胞MØ集落刺激因子(GM-CSF)在MØs中诱导癌抑素M (OSM)的表达，这反过来又诱导促肿瘤炎症介质的表达和分泌，如IL6家族成员(如IL6和LIF)和CXC-和cccl7趋化因子(CXCL1, CCL2和CCL7)，间质成纤维细胞。这种异常的信号环境参与肿瘤细胞的生存，运动和细胞迁移信号通路加速转移。将胰腺癌细胞(PCC)原位移植到缺乏OSM (Osm^-/-) 的免疫活性小鼠中，产生的肿瘤显著变小，其微环境发生改变，促肿瘤细胞因子和趋化因子(IL6, CXCL1, TNFα和GM-CSF)减少，αSMApos肌成纤维细胞的丰度增加。同源的OSM受体OSMR在间质细胞中表达，特别是在成纤维细胞和血管周细胞中。值得注意的是，OSMR表达水平与炎症基因表达、肿瘤免疫浸润和人PDA中的总体存活率相关。

在PDA中，OSMR在间充质细胞如CAFs、内皮细胞和周细胞中表达，OSM在免疫细胞如MØs、髓系细胞、树突状细胞和中性粒细胞中表达。值得注意的是，OSMR^high CAFs在PDA动物模型中炎症信号表达水平更高，如Il6、Ccl7、Ccl2和Cxcl1，在人类PDA中表达更高水平的OSMR，并与肿瘤免疫浸润和患者预后有关。在体外，癌细胞、MØs和成纤维细胞的共培养以及重组OSM增加了成纤维细胞中OSMR的表达和炎症信号的产生。然而，虽然现有的数据表明异细胞OSM-OSMR信号作为炎症成纤维细胞的调节因子，但是还需要未来进行更深入的研究，以确定是否OSM-OSMR信号直接涉及肿瘤细胞和其他基质细胞群体在PDA中发挥额外的作用。

总之，本文所提供的数据表明异细胞OSM-OSMR信号在建立PDA环境中的作用，并强调OSM-OSMR信号作为PDA的一个假定的治疗靶点。

参考文献

[1]Lee, B.Y., Hogg, E.K.J., Below, C.R. et al. Heterocellular OSM-OSMR signalling reprograms fibroblasts to promote pancreatic cancer growth and metastasis. Nat Commun 12, 7336 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-27607-8.

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