结直肠癌前病变多组学图谱揭示两种常见结直肠息肉的不同癌变路径

研究背景

人类结直肠癌(CRC)的分类主要依据肿瘤细胞的内在特征，包括组织病理学、基因表达、染色体不稳定性(CIN)、高甲基化和微卫星不稳定性(MSI)等。肿瘤免疫微环境也是CRC发病机制的关键因素。高突变MSI-H肿瘤表现出新抗原触发的细胞毒性免疫浸润，这有助于它们对免疫治疗的反应性。然而，低突变负荷CRC似乎通过某个重要而不明确的机制激活免疫微环境。因此作者假设，在MSI-H和微卫星稳定型（MSS）CRC前体中绘制肿瘤发生的路径，将揭示定义CRC细胞图景的机制，并确定具有诊断或治疗效用的靶点。在本文中，作者呈现了一个多组学人类癌症前图谱，整合了单细胞转录组、基因组学和免疫组织病理学，描述了两种最常见的CRC通路。识别和功能验证了不同CRC的起源和分子过程，建立不同的肿瘤景观。

方法流程

作者从COLON MAP（Colorectal Molecular Atlas Project）研究参与者中收集息肉以及匹配的正常活检样本。使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)、全外显子测序（WES）、多重免疫荧光(MxIF)和多重免疫组化(MxIHC)等方法对两组样本进行了实验与分析。结合了公共数据集数据，同时构建了基因工程小鼠模型进行验证。

图1 方法流程示意图

研究结果

①不同的组织病理学和分子特征定义结肠癌前细胞（pre-cancer）亚型

在组织学上将息肉分为两种亚型：腺瘤（adenomas, AD）和锯齿状息肉（serrated polyps, SER）。前者包括管状腺瘤（tubular AD, TA）和管状绒毛腺瘤（tubulovillous AD, TVA），后者包括增生性息肉（hyperplastic polyps，HP）和无柄锯齿状病变（sessile serrated lesions, SSL）。HP进一步细分为杯状细胞丰富型的GCHP（goblet cell-rich HP）和微泡型的MVHP（microvesicular HP），其中MVHP较晚期，可能发展为SSL。

随后，作者通过全外显子组测序(whole-exome sequencing, WES)对AD和SER的突变谱进行了表征。在85%的TA和两个TVA中均检测到APC突变，而SSL无APC和KRAS突变。即SSL未表现出高突变表型，而部分TA/TVA表现出高突变表型。同时，信号通路分析揭示了WNT诱导肿瘤发生在TA和TVA中，而不是SSL。

图2 人类结肠癌前细胞的特征

②单细胞分析确定了来自亚型特异性肿瘤发生过程的肿瘤细胞

作者获得DIS组70691个细胞和VAL组71374个细胞，共142065个细胞的单细胞RNA测序数据。UMAP图显示有7个正常的上皮细胞簇。息肉标本中也含有大量符合组织病理的正常细胞。然而，有两个细胞簇在息肉样本中占绝大多数。1个cluster在TA和TVA中富集，以下简称为ASC(AD-specific cells)，另1个cluster富集于SSL和HP，以下简称SSC(serrated-specific cells)。

作者比较了ASC和SSC中与正常上皮细胞相比差异激活的基因程序和通路后，发现ASC与结肠干细胞和祖细胞表达模式相似，表达了WNT通路激活的基因(LGR5,OLFM4,ASCL2,AXIN2,RNF43,EPHB2)，并且具有比来自同一个体的正常干细胞更强的干细胞特性。这表明WNT依赖的干细胞扩增在AD中启动肿瘤发生，通常是由APC功能缺失突变驱动的。

与ASC形成鲜明对比的是，SSC既没有激活WNT通路，也没有干细胞特征。SSC的转录组谱类似于吸收细胞系（absorptive-lineage cells），但SSC也表达功能性杯状细胞基因，包括TFF3和MUC2，这表明具有混合的细胞特性。CDX2在大多数结肠细胞中都有表达，包括ASC。然而，它在SSC中被下调，支持这些细胞中区域特性的丧失。这些分析描述了SSC结肠身份的损失，并提供了进一步的证据，表明产生SSC产于胃化生过程。

图3 癌症前的单细胞基因表达和调控网络景观

③锯齿状息肉起源于细胞，不同于腺瘤

为了提供肿瘤起源的组织学证据，作者通过多重成像绘制肿瘤细胞的位置。干细胞标记物OLFM4和SOX9在AD中丰富，在HP和SSL中明显减少。在正常结肠和AD中检测到CDX2，但在HP中检测到CDX2表达量下降，而在SSL中则未检测到。MUC5AC是SSC的标记物，在HP和SSL中高表达，但在正常活检和AD中不表达。MUC5AC阳性的肿瘤细胞经常出现在隐窝顶部，而正常MUC5AC阴性的细胞则出现在隐窝底部，这意味着SER非隐窝起源。MUC5AC阳性细胞首先出现在GCHP的管腔表面，然后在MVHP和SSL中进一步延伸到隐窝基底，与这些SER的组织病理学进展一致，并支持SSC的腔表面起源。腔表面结肠细胞易受损伤诱导的化生的影响，如果损伤不能解决，可能引起锯齿状息肉的形成。CytoTRACE评分和WNT靶基因重叠识别出了与ASC共享的干细胞分支，提示AD的起源是异常扩张的干细胞。与此形成鲜明对比的是，SSC是由吸收祖细胞和结肠细胞发展而来的。单个肿瘤的RNA速率（RNA velocity analysis）分析在很大程度上证实了这些发现。在正常标本中，速度载体来源于干细胞，并流向分化的细胞类型。ASC被认为是由干细胞发育而来的，但是SSC的速度载体是相反的，这表明这些细胞的起源是非干细胞。

图4 推断癌症前细胞的起源

④从癌前到癌的恶性进展过程中，亚型特异性特征发生改变

除了息肉外，作者对新鲜的CRC标本进行了scRNA-seq，并获得了CRC scRNA-seq数据集。CRC标本的WES显示MSS CRC遵循传统的肿瘤发生途径，APC(100%)、KRAS(35%)和TP53(71%)突变，具有预期的突变特征。MSI-H CRC中这些常规突变较少(分别为33%、0%、7%)，但BRAF突变较多(MSI-H中为53%，MSS中为0%)。与MSS CRC相比，所有MSI-H CRC均发生高突变。scRNA-seq数据显示肿瘤与肿瘤之间存在显著的区别。MSS CRC细胞过表达再生隐窝基干细胞的特征，而MSI-H CRC细胞保留了化生特征。恶性细胞和癌前细胞之间的共同特征提供了前体-癌症关系的额外证据。此外，与息肉相比，两种CRC亚型都激活了它们的增殖超调节，富集了DNA合成和修复程序。WNT信号超调控在ASC和MSS CRC细胞中持续上调，而MSI-H CRC中非APC WNT通路组分的激活突变获取支持WNT通路的激活，包括RNF43(60%)、TCF7L2(53%)、ZNRF3(33%)、APC2(27%)、AXIN2(20%)、FAT1(33%)、FAT2(47%)和FAT4(40%)。TCGA WES数据也显示在MSI-H CRC中富集了非APC WNT通路基因突变。这些结果表明，MSI-H CRC通过转化为更具侵袭性的干细胞获得了与化生无关的事件。

图5 CRC肿瘤细胞UMAP、癌前衍生基因集的热图、单细胞CMS评分、CytoTRACE评分及TF靶网络

⑤从化生到干细胞的转变有助于MSI-H型CRC的肿瘤异质性

MSS CRC (0/17)中无MUC5AC染色阳性，但大多数MSI-H CRC(13/14)染色阳性。CDX2染色呈相反趋势：MSS CRC中几乎所有肿瘤细胞均为CDX2阳性，而MSI-H CRC的CDX2染色均有不同程度的降低。干细胞标记物(OLFM4, SOX9)在MSS CRC中均有表达，且均缺乏MUC5AC表达。SOX9在MSI-H型CRC中普遍上调表达，提示所有恶性细胞均获得一定程度的干细胞。作者进一步通过MLH1染色推断细胞的微卫星状态，进一步证实了CRC组织中CDX2和MUC5AC表达的异质性。

图6 化生特征和干性特征的CRC异质性分析

⑥锯齿状息肉在高突变前与细胞毒性微环境有关

作者结合分析了来自癌前和CRC的非上皮scRNA-seq数据，并根据marker基因表达及其在肿瘤亚型之间的组成变化确定了不同的细胞类型。AD和SER在CD8⁺T细胞中与细胞毒性和衰竭相关的基因特征没有差异，但与MSS CRC相比，MSI-H的CD8⁺T细胞中的基因特征增强。与正常结肠CD4⁺T细胞相比，AD衍生的FOXP3调节活性更高，这与一定程度的Treg依赖免疫抑制相一致。ASC表达吸引单核细胞的趋化因子特征，而SSC表达吸引淋巴细胞的细胞因子特征。这些数据说明了一些适应性免疫调节机制的持久性，从癌症前到癌症，似乎独立于高突变。多重成像显示，与AD相比，SER具有更高数量的T细胞、CD8⁺T细胞，以及更高的CD8⁺/CD4⁺T细胞比例，而其他免疫细胞没有显著区别。髓系细胞丰度在scRNA-seq水平和成像中均显示无差异，但CD68⁺巨噬细胞均匀分布在AD基质中，而在SER的管腔表面集中，与MUC5AC⁺化生细胞的表面位置一致。MSI-H CRC中CD8⁺T细胞的异质性分布反映了观察到的肿瘤细胞的异质性。MUC5AC⁺化生区CD8⁺T细胞显著增多，而OLFM4⁺干性区CD8⁺T细胞数量减少。这些结果加强了SER的化生起源和细胞毒性免疫微环境之间的联系，并影响免疫抑制，例如肿瘤细胞获得干性。

图7 结肠肿瘤各亚型的免疫图谱

⑦肿瘤细胞分化状态塑造适应性免疫微环境

为了确定锯齿状肿瘤发生中的细胞毒性反应是否与高突变前的肿瘤细胞状态有关，作者使用基因工程小鼠模拟最早的肿瘤发生。驱动BRAF激活突变不会导致宏观肿瘤，但会诱导结肠近端绒毛状化生。与正常结肠对照相比，Apc突变的肿瘤中β-catenin染色升高，CD8⁺T细胞数量减少，这与人类AD和MSS CRC一致。相比之下，Braf突变与CD8⁺T细胞浸润增加相关，显著的是，仅在分化细胞中，而不在突变隐窝中。因此，病变中突变的分化细胞，而不是干细胞，驱动细胞毒性免疫微环境。随后，作者对肿瘤组织和对照结肠进行了scRNA-seq，并识别出肿瘤特异性细胞，包括异常Paneth细胞。由于WNT驱动的共同突变过程，两种肿瘤类型的肿瘤特异性细胞(TSC)形成了一个没有化生基因标记的过表达Lgr5的细胞群。此外，两种肿瘤类型都表现出β-catenin染色升高，反映WNT激活。

图8 肿瘤细胞分化状态的功能验证及对细胞毒性免疫的影响

结论

根据本文所有实验和分析，作者推测腺瘤和锯齿状肿瘤发生的机制根本不同:前者来自DNA复制诱导的不断更新的干细胞突变，后者来自腔内环境中外来应激源触发和维持的结肠表面损伤和修复。肿瘤细胞的不同起源选择肿瘤发生所需的不同突变途径。生物标志物，如MUC5AC染色与CDX2的缺失相结合，可能证实可疑的SSL病变的诊断。此外，在人类肿瘤中，SSL中的细胞毒性免疫反应先于高突变，这与近期小鼠模型显示的顺序一致。高突变是MSI-H型CRC的特征之一，由此产生的高新抗原负荷被认为是细胞毒微环境的关键驱动因素。本文的数据表明，分化状态的肿瘤细胞，由于它们之前暴露于腔内微环境，更擅长抗原呈递和建立一个活跃的免疫环境。肿瘤细胞如何分化表型获得和维持免疫刺激特性仍有待确定。通过MSI-H CRC获得干细胞特性有助于肿瘤内的空间异质性:化生区域保留了它们与细胞毒性免疫细胞的联系，而干细胞区域与免疫抑制细胞和信号相关。未来的研究将需要确定这些癌症中获得干细胞是否影响免疫治疗反应的可能性。与SSL相关的自上而下的空间组织、分化和化生转录程序以及细胞毒性免疫环境可能为阻断癌症进展开辟新的策略，包括更好的监测、化学预防或生物疗法。

参考文献

1、Aibar, S., Gonza´ lez-Blas, C.B., Moerman, T., Huynh-Thu, V.A., Imrichova, H.,Hulselmans, G., Rambow, F., Marine, J.C., Geurts, P., Aerts, J., et al. (2017).SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nat. Methods 14, 1083–1086.

2、Alshetaiwi, H., Pervolarakis, N., McIntyre, L.L., Ma, D., Nguyen, Q., Rath, J.A., Nee, K., Hernandez, G., Evans, K., Torosian, L., et al. (2020). Defining the emergence of myeloid-derived suppressor cells in breast cancer using single-cell transcriptomics. Sci. Immunol. 5, eaay6017.

- THE END -

往期推荐

新格元秉持“格物致知，识微通元”的创新性理念，致力于发展简便可靠的单细胞组学技术，更新细胞病理和血液检测方法，让单细胞组学以传统方法无法比拟的精确度、灵敏度和分辨率服务于精准医疗和健康管理等领域。

格物致知，识微通元

公司电话：[phone]

技术联系电话：[phone]

合作邮箱：[e-mail]

官网：www.singleronbio.com

地址：南京市江北新区药谷大道11号加速器二期6栋4-5

地址：苏州市工业园区星湖街218号生物纳米园B4楼401