项目文章|单细胞测序解密小胶质细胞在增殖性糖尿病视网膜病变纤维血管膜中的新角色
近日，南京医科大学第一附属医院眼科刘庆淮教授团队采用新格元单细胞测序技术揭示小胶质细胞在增殖性糖尿病伴发视网膜病变（PDR）中起着关键作用。在国际糖尿病领域顶级期刊《DIABETES》上发表了题为“Single-cell transcriptomics reveals novel role of microglia in fibrovascular membrane of proliferative diabetic retinopathy”的研究文章，本文胡仔仲博士、茅希颖博士为第一作者，刘庆淮教授和袁松涛教授为通讯作者。该课题对接受玻璃体切除手术的5例PDR患者的纤维血管膜进行剥离取样，获得单细胞悬液，通过GEXSCOPE®单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）对糖尿病视网膜病变患者的玻璃体纤维血管膜进行检测并数据分析。
增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）是糖尿病的主要并发症之一，在世界范围内仍是视力丧失严重的主要原因之一。玻璃体纤维血管膜（FVMs）位于视网膜与玻璃体之间，可引起玻璃体出血和视网膜脱离，是PDR的重要病理标志之一。然而，目前对于PDR-FVMs的发病机制了解非常有限，甚至对于其上的细胞构成观点不一。传统的研究方法有免疫组化、二代测序、体外细胞实验、体内动物实验等。但是免疫组化只能对1-2个细胞表达的标志物探索，二代测序笼统地进行增殖膜整体测序，皆无法分析细胞的异质性；细胞和不成熟的动物模型都无法精确模拟PDR-FVMs的病理过程。本研究利用单细胞测序对PDR患者的FVMs组织进行单细胞重测序，揭示FVMs的细胞异质性，并为解析PDR疾病的分子机制和靶向治疗提供理论基础。
作者对5例PDR患者的玻璃体切除手术组织中分离得到FVMs细胞，共得到6894个细胞，进一步通过细胞的基因谱可以细分为8种细胞类型，包括小胶质细胞（MG）、单核细胞（Mono）、巨噬细胞(Macro)、成纤维细胞(Fibro)、周细胞(Peri)、内皮细胞(Endo)、树突细胞(DC)和T淋巴细胞(T)。其中异MG亚群占比最大。对MG亚群进一步细分，又可分为4个亚群：MG(1)、MG(2)、MG(3)、循环MG。MG(1) 类似于多种神经退行性疾病中脂斑周围积聚的激活小胶质细胞；MG(3)高表达SELENOP、MRC1和IGF1，与抗炎激活相关；MG(2) 高表达CX3CR1信号通路之前被证明可以维持视网膜内稳态，并与周围损伤相关1。循环MG高表达多个细胞周期相关基因(如MKI67、CENPF)，表明FVMs上存在小胶质细胞增殖（图1）。接着，作者对FVMs上小胶质细胞、人类视网膜组织小胶质细胞、人类外周血单核细胞（PBMC）进行整合并拟时序分析，发现FVMs上的小胶质细胞可能来源于视网膜（图2）。
图2 FVM驻留小胶质细胞与视网膜小胶质细胞的相似性
进一步，作者描述了小胶质细胞亚群MG（1）中的基因表达模式。利用基因组变异分析（GSA）发现促纤维化相关基因表达在MG（1）中显著富集，包括CTSB, SPP1和LGALS3等。MG（1）还高表达纤维连接蛋白(FN1)，骨连接蛋白(SPARC)和转化生长因子β诱导蛋白(TGFBI)等胞外基质相关基因（图3），说明MG（1）的自身纤维化和促纤维化特性。
图3 FVMs中被激活的小胶质细胞的促纤维化特征
最后，作者研究了PDR微环境，及玻璃体中的细胞因子与FVMs上细胞间可能的相互作用。PDR玻璃体与正常对照组相比，PDR玻璃体中有23种细胞因子显著上调。提取这23种细胞因子，在FVMs不同细胞类型中评估分析细胞因子受体的表达水平，发现NRP1、NRP2、TGFBR1和LRP1在MG(1)和间充质细胞中特异性表达，其同源配体VEGFA、TGFB和CTGF已被证明可诱导各种器官的纤维形成3。且MG(1)表达的受体亚群也在单核细胞和树突细胞中富集，如IFNGR、CD44、CD74、CCR1和CCR5。这些受体通常与配体IFNG、MIF和CCL相互作用，它们是巨噬细胞动员和激活的关键调节因子。与健康视网膜小胶质细胞相比，FVMs上的小胶质细胞中的受体CCR1、CCR5、IFNGR1、CD44、CXCR4和NRP1均显著上调。进一步利用CellChat对各种细胞间的配-受体进行分析，发现SPP1是主要表达于MG(1)的配体，并参与成纤维细胞主导的信号传导，参与组织重构（图4）。
图4 促纤维化小胶质细胞在PDR特异性微环境中的单细胞间相互作用
总结
FVMs由于其取样较为困难，组织量小，导致目前的单细胞研究较少。本研究中作者对5例PDR患者切除玻璃体后，再用切割头对FVMs切割、收集，进行单细胞测序。分析发现小胶质细胞在FVMs组织中具有非常重要的作用，FVMs中的小胶质细胞起源于视网膜小胶质细胞，且表现促纤维化特性和本身纤维化特性。这些结果为更好地了解人类FVMs的细胞组成和功能以及未来介入靶点的发展提供了理论基础。
参考文献
1.Zhang Y, Zhao L, Wang X, et al. Repopulating retinal microglia restore endogenous organization and function under CX3CL1-CX3CR1 regulation. Science Advances 2018;4:eaap8492.
2.Jin N, Gao L, Fan X, et al. Friend or Foe? Resident Microglia vs Bone Marrow-Derived Microglia and Their Roles in the Retinal Degeneration. Molecular neurobiology 2017;54:4094-4112.
3.Lopes TG, de Souza ML, da Silva VD, et al. Markers of renal fibrosis: How do they correlate with podocyte damage in glomerular diseases? PloS one 2019;14:e0217585.
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