项目文章 | 单细胞测序客户文章持续不断！新格元单细胞技术助力解析肾移植后慢性抗体介导排斥反应的相关机制
材料：2例肾移植术后cABMR患者和2例对照患者的外周血样本
期刊：Frontiers in Immunology
发表时间：2022年1月
方法：Singleron GEXSCOPE®
研究路线图
研究背景和研究目的
肾移植是目前治疗终末期肾病最有效的方法。然而，慢性抗体介导的排斥反应（cABMR）仍然是肾移植患者长期生存的严重障碍，是一个有待解决的问题。目前，T细胞和B细胞亚群等免疫因子在肾移植后cABMR中的作用和机制尚不清楚。本研究期望通过单细胞测序对cABMR发病机制进行全面的解析。
研究内容概述
本研究中，对cABMR和对照受试者的外周血单核细胞（PBMC）进行scRNA-seq，以在单细胞分辨率下分析转录组学景观。结果表明，cABMR患者的大多数细胞类型释放干扰素反应和促炎细胞因子，T细胞和B细胞中MTND6、CXCL8、NFKBIA、NFKBIZ等表达上调，这些基因与促炎症反应和免疫调节有关。Western blot和qRT-PCR实验也证实这些基因在cABMR中表达上调。GO和KEGG富集分析表明，T细胞和B细胞中高表达的基因主要富集在炎症途径中，例如TNF、IL-17和Toll样受体信号通路。此外，MAPK和NF-kB信号通路也参与了cABMR的发生发展，与western blot的实验结果一致。拟时轨迹分析显示T细胞亚群具有三条独特的转录分化路径，细胞相互作用分析显示cABMR中有较强的T/B细胞和中性粒细胞激活。该研究为cABMR的发病机制提供了新的见解，同时对确定新的治疗靶点具有指导意义。
主要研究内容
1、cABMR患者免疫细胞亚群组成
scRNA-seq数据中细胞降维聚类结果显示10种主要的细胞类型，分别为T细胞、B细胞、NK细胞、经典单核细胞、非经典单核细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、中性粒细胞祖细胞和中性粒细胞，本结果明确了肾移植后患者外周血细胞群的组成。
图1 cABMR患者与对照组免疫细胞亚群组成
2、cABMR患者T细胞亚群的免疫学特征
为了分析cABMR患者T细胞亚群表达的变化，对T细胞进行亚群细分显示具有四种，分别为：CD8粘膜相关T细胞、gd T细胞、CD8效应T细胞和初级T细胞/中央记忆T细胞。
图2 T细胞亚群细分相关结果
cABMR组中gd T细胞、CD8效应T细胞和CD8_MAI T细胞中的DEG表达上调，包括MT-ND6、CXCL8、S100A9等。线粒体基因MT-ND6在排斥反应中的作用和机制尚未见报道，MT-ND6表达上调可能与线粒体氧化应激有关。CXCL8和S100A9参与中性粒细胞的激活，它们还参与NF-kB信号通路的激活，NF-kB在炎症和肿瘤中已被广泛研究，但其在抗体介导的排斥反应中的作用尚不清楚。CXCR4通过与CXCL12结合并激活各种下游信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，一些关于CXCR4在免疫排斥反应中作用的研究表明，其拮抗剂可以有效降低移植后排斥反应的强度，观察结果与我们的结果一致。GO和KEGG富集分析证实NF-kB和MAPK信号通路均参与T细胞激活和抗体介导的排斥反应；这可能与NF-kB和MAPK信号通路介导的炎症反应有关，它们对免疫细胞的调节作用有待于进一步研究证实。
图3 T细胞亚群功能富集结果展示
进一步研究T细胞亚群的分化轨迹，共获得三条路线轨迹。与对照组相比，cABMR组显示出完全不同的分化轨迹，表明cABMR中T细胞亚群的分化途径并不一致。为了比较T细胞亚群的差异，根据之前定义的四个亚群对每个亚群进行轨迹分析。CD8效应T细胞和gd T细胞显示出三种不同的分化轨迹，而CD8效应T细胞和原始T细胞主要有两种分化轨迹。此外，还评估了差异表达基因的时间模拟轨迹的变化，总共获得了4个差异表达基因簇，例如在簇1中，共有15个差异表达基因最显著的DEG（包括MT-ND6、CXCL8、CD69和PAXBP1）被富集，这与GO和KEGG富集分析的结果一致。
图4 T细胞亚群的拟时轨迹分析结果展示
在T细胞和B细胞的转录组分析中，使用GO和KEGG富集分析发现T细胞、B细胞和中性粒细胞的持续激活。这些结果表明，细胞间的相互作用可能参与了cABMR的发生和发展。因此，研究细胞间通讯和信号网络的相互作用可能为发现cABMR的新治疗靶点提供新的见解。图5显示了不同类型免疫细胞中受体和配体之间的潜在相互作用。例如CD8 MAIT细胞、CD8效应T细胞和gd T细胞之间的相互作用最强，趋化因子途径分析显示CCL5-CCR5信号轴在gd T细胞与CD8 MAIT细胞、CD8效应T细胞与CD8 MAIT细胞内最强。gd T细胞通过CD94:NKG2A/C-HLA-E信号轴激活其他亚群。因此，gd T细胞可能参与cABMR的发病机制，并通过激活CD8+T细胞诱导其他细胞的损伤。
图5 细胞相互作用分析
结论
本研究为全面描述肾移植后cABMR的复杂动态免疫反应奠定了基础。我们鉴定了一系列涉及cABMR患者信号通路和潜在配体-受体相互作用的新靶点，可以作为cABMR丰富的转录组资源，并为设计潜在的新疗法提供指导建议。
参考文献
Front. Immunol., 17 January 2022 | https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.767618