项目文章 | 高通量scRNA-Seq研究实验性自身免疫性睾丸炎诱导的间质细胞衰老：间质纤维化和补体激活的重要作用
单细胞测序客户文章停不下来！今天为大家带来的是由南通大学医学院生殖医学研究所孙斐教授实验室李因传老师利用新格元单细胞技术在Frontiers in Immunology期刊发表的“High Throughput scRNA-Seq Provides Insights Into Leydig Cell Senescence Induced by Experimental Autoimmune Orchitis: A Prominent Role of Interstitial Fibrosis and Complement Activation”。
材料：1组睾丸炎雄鼠和1组对照成年雄鼠的睾丸样本
期刊：Frontiers in Immunology
发表时间：2022年1月
方法：Singleron GEXSCOPE®单细胞测序技术
研究思路
研究背景和研究目的
睾丸间质细胞(Leydig cells, Lc)是男性性分化、精子发生和维持男性第二性特征的关键。Lc在老化的睾丸中容易衰老，导致雄激素的合成能力降低。然而，关于Lc是否在慢性炎症环境中经历衰老则知之甚少。为了探讨这个问题，本文使用小鼠实验性自身免疫性睾丸炎(EAO)模型，并通过高通量scRNA-Seq来确定诱导Lc衰老的相关细胞因子和信号通路。
研究内容概述
利用小鼠实验性自身免疫性睾丸炎(EAO)模型，通过高通量scRNA-Seq分析Lc，对衰老、凋亡、雄激素合成和细胞因子/趋化因子通过相关信号通路进行筛选和分析。结果表明，EAO诱导Lc衰老，而Lc衰老反过来拮抗雄激素合成。通过对诱导Lc衰老的通路进行相关性筛选，发现EAO过程中有大量通路可能触发Lc衰老，其中Arf6和血管生成素受体通路与衰老特征高度相关。EAO激活的补体和间质纤维化加重了Lc的衰老，并强烈拮抗雄激素的合成。大多数促炎细胞因子在EAO过程中同时促进Lc和精原细胞的衰老和凋亡，而促炎细胞因子对谷胱甘肽代谢途径的拮抗可能是EAO过程中诱导细胞衰老的关键。
主要研究内容
一、慢性睾丸炎引起Lc衰老
scRNA-seq数据中细胞降维聚类结果分为17个细胞群，包括1个精原细胞（Sg）群，4个精母细胞（Sc）群，9个精子细胞（Sd）群，1个Lc细胞群，1个支持细胞（St）群和1个免疫细胞（Im）群。通过分析了O50t和Nt中每个细胞群的基因表达的变化情况，结果显示，睾丸炎导致了基因表达的广泛改变。同时睾丸炎伴有抗生殖细胞抗体的浸润增加。
本文评估了Lc中衰老特征与雄激素合成特征和Hallmark雄激素反应通路之间的相关性。结果显示，衰老特征与雄激素反应通路呈显著负相关，并与雄激素合成特征呈显著负相关。除Lc外，通过比较衰老和凋亡的基因和表征，发现树突细胞（Dc）细胞具有更高的衰老潜能。
图1 雄性B6小鼠(O50)和正常成年小鼠睾丸的scRNA-Seq
二、EAO对氧化还原相关通路的下调及Lc中衰老相关通路的筛选
为了阐明在睾丸炎过程中Lc衰老和雄激素合成的调控，比较了Lc_Nt和Lc_O50t之间Hallmark基因集、KEGG通路和PID信号通路的相对表达水平。发现睾丸炎可能会提高Lc的炎症反应。例如，在EAO过程中，Hallmark补体、TNF-α信号通路、TGF-β信号通路、KEGG花生四烯酸代谢、KEGG补体和凝血级联的基因集得分水平均增加。
EAO过程中氧化还原状态和雄激素合成途径可能受到损害。氧化磷酸化、活性氧、脂肪酸代谢、雄激素反应、糖酵解和类固醇生物合成的基因组水平显著下调。更重要的是，Hallmark p53通路和PID Arf6通路的升高暗示着在EAO期间Lc可能已发生衰老。
通过相关性分析筛选了Lc衰老的影响途径。本文使用了经典的衰老信号:Cdkn1a、Cdkn1b、Cdkn1c等。结果显示，在Lc_Nt中，具有衰老特征的高度相关的通路与REACTOME细胞衰老通路不同。但二者在Lc_O50t中共享许多正相关的通路，表明衰老发生在Lc_O50t中。值得注意的是，无论在Lc_Nt还是Lc_O50t中雄激素合成特征都显示出与衰老相反的相关模式。在睾丸炎过程中，包括Arf6和血管生成素受体通路在内的许多信号通路在Lc中增加。
图 2 EAO期间间质细胞衰老相关通路的筛选
三、睾丸炎对雄激素合成相关通路的影响以及补体激活对雄激素合成的显著负作用
为了探讨EAO过程中炎症的影响因素，本文还监测了慢性炎症诱导的间质纤维化及其相关信号通路。事实上，Lc很可能是纤维化的主要来源之一，因为在睾丸炎期间Lc的整体胶原水平被大量诱导，其中Col3a1、Col4a1和Col1a2成为睾丸炎过程中主要表达的胶原蛋白。
通过检测Lc_O50t和Lc_Nt中三种胶原基因的TFs的相关性，利用胶原蛋白的特征基因集来筛选Lc_Nt和Lc_O50t的相关通路。本文使用Col22a1作为标记来筛选Lc_Nt中的相关通路。Lc_Nt中的Col22a1和Lc_O50t中的胶原都具有许多与雄激素合成呈负相关的相似通路。但在EAO过程中，与胶原蛋白高度相关的信号通路与补体特征和KEGG补体、凝血级联通路有很高的相关性。
纤维化改变了Lc和Im细胞之间的通信和黏附模式。在睾丸炎期间，Lc vs. Lc和Lc vs. Im的胶原整合素受体配体对数量增加。在EAO过程中，纤维化与补体密切相关，两者都可能拮抗雄激素合成，增强Lc衰老。活性氧下调和补体通路上调与间质纤维化密切相关。
图3 雄激素合成、衰老与炎症反应的关系
四、EAO过程中促炎细胞因子增强了Lc和Sg细胞的凋亡和衰老，并拮抗其谷胱甘肽代谢途径
本文研究了Lc和Sg中25个促炎细胞因子基因集、信号通路表征之间的相关性。在Lc_O50t中，大多数细胞因子信号通路与衰老特征和细胞凋亡均呈正相关，而与雄激素合成特征呈负相关，表明在EAO过程中，大多数促炎细胞因子可能同时诱导Lc和Sg衰老和凋亡，降低了Lc的雄激素生成。
最后，本文筛选出了在EAO过程中Lc和Sg中与大多数促炎细胞因子呈负相关的通路。其中细胞色素p450介导的KEGG谷胱甘肽代谢和外源性KEGG代谢与EAO过程中多数促炎细胞因子通路呈负相关，于是对KEGG_谷胱甘肽代谢通路进行相关性分析。结果表明大多数促炎细胞因子增强了Lc_O50t的纤维化和补体，同时降低了Hallmark氧化磷酸化、活性氧和KEGG谷胱甘肽代谢。这也暗示参与谷胱甘肽代谢的途径是Lc和Sg中大多数促炎细胞因子/趋化因子的关键潜在靶点。
图4 EAO期间Lc和Sg对促炎因子的不同反应
结论
本研究主要采用通路或表征作相关通路的筛选，弥补了基因差异分析的局限，进一步阐明了基因调控网络及其在胁迫过程中的后续变化。该研究为睾丸炎中雄激素合成的调节和间质细胞炎症性衰老提供了新的重要见解。
参考文献