Nat. Chem. Biol.|通过定向进化发展能够修饰淀粉样蛋白的Sortase
大家好，今天给大家分享一篇最近发表在Nature Chemical Biology上的研究，题为：Laboratory evolution of a sortase enzyme that modifies amyloid-β protein，文章的通讯作者是哈佛大学的David R. Liu教授。
图1. 本文所使用的定向进化策略
随着分子生物学等手段的发展，定向进化已经成为了极其有力的工具手段，在发展新型的催化剂、诊断试剂以及药物等方面都展现出了广阔的应用前景。然而许多在体外进化出的功能无法在体内的真实环境下发挥作用，同时在试管与孔板中进行的筛选相对低效，间接限制了该方法的进一步应用。在本文中，作者利用酵母展示技术对一种转肽酶（Sortase，Srt）进行定向进化，成功地获得了能够高特异性修饰β-淀粉样蛋白（amyloid-β (Aβ) protein）的Srt，该结果进一步展示了定向进化的适用性，同时也为淀粉样蛋白的研究提供了新的工具。
Sortase A（SrtA）能够特异性识别蛋白C端LPXTG序列，选择性将T与G之间的肽键断裂，并将N端为GGG的蛋白与T连接，形成新的蛋白质偶联物。Sortase被广泛地应用于蛋白质的定点修饰，人们对Sortase的结构进行过大量的优化，发展出了具有不同底物特异性的突变体。Aβ中含有LMVGG序列，与SrtA识别的结构较为类似，作者希望通过定向进化改变SrtA的识别序列，并实现在生理条件下对Aβ特异性标记与修饰。整个筛选过程如图1所示，作者通过酵母展示技术将Srt展示于酵母表面，并进行了GGG修饰；随后加入生物素标记的底物（LXXXG）进行偶联，反应结束后分别通过荧光对Srt的表达水平（FITC标记）与生物素的标记水平（PE标记）进行定量，通过流式细胞术对目的细胞进行分选，保留高PE/FITC的酵母细胞。相比于在孔板中的定向进化，该方法可以同时对于数以千计的突变株进行筛选，极大的提高了筛选效率。
图2. 酵母表面反应体系的构建
作者选取了底物识别序列为LPESG的Srt（4S.6）进行进化，通过易错PCR建立了含有4.8 × 107的突变库，并以LPVGG为底物首先进行了筛选，并在过程中逐渐加入竞争底物以提高筛选的特异性。在7轮筛选后，发现有11处突变位点占有较高的比例，其中3处在筛选早期就已经出现，并且存在于该酶底物识别的位点，作者对这三个位点进行了保留，并建库继续进行了筛选。由于作者最终想要实现在血液中的选择性标记，他们对血浆中可能存在的干扰底物进行了负筛选，降低了潜在的影响。在筛选的过程中，他们会根据上一轮结果继续设计下一轮的筛选库，以提高筛选的效率。16轮筛选后，他们对突变库对LMVGG的反应活性进行了鉴定，并通过流式分选获得了反应性最高的突变SrtAβ，其对LMVGG的反应性较4S.6提高了1470倍。SrtAβ与4S.6之间存在25处突变，作者通过突变实验说明，虽然每处突变带来的结果有限，但是这些突变结合起来能够对酶活产生极大的影响（图3）。
图3. 进化前后酶的底物选择性以及关键突变位点
SrtAβ能够在血清中标记低至5nM的Aβ，并可以在脑脊液中对内源Aβ的标记（图4）。除了标记外，作者利用该酶将AβM1–42末端的疏水片段改变为亲水片段，抑制了其淀粉样组装，表明该酶也能够在神经退行性疾病的治疗中起到作用。
图4. SrtAβ实现了对人体样本中的Aβ进行标记
总结来说，作者通过定向进化对Srt的功能进行了改造，实现了对生理样本中的Aβ进行高效标记。本文的结果亦说明酵母是能够进行定向进化的合适载体，为该技术的进一步发展打下了良好的基础。
作者：Roy Wu 审校：XW
Podracky, C. J.; An, C.; DeSousa, A.; Dorr, B. M.; Walsh, D. M.; Liu, D. R., Laboratory evolution of a sortase enzyme that modifies amyloid-beta protein. Nat. Chem. Biol. 2021, 17 (3), 317-325.
Link: http://www.nature.com/articles/s41589-020-00706-1