JACS|利用小分子模型对GPx的催化过程进行研究

大家好，今天给大家分享一篇最近发表在JACS上的研究，题为：Modeling the Catalytic Cycle of Glutathione Peroxidase by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopic Analysis of Selenocysteine Selenenic Acids，文章的通讯作者是东京工业大学的Kei Goto教授。

图1. 左：广泛接受的GPx的催化机理；右：本文的研究思路

谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）在维持人体氧化还原平衡中扮演了重要的作用，其主要功能是催化谷胱甘肽还原过氧化氢，对其功能与催化机理的研究将会为相关疾病的治疗以及发展小分子模拟酶提供重要的基础。GPx的活性中心是具有高度反应活性的硒代半胱氨酸（selenocysteine， Sec），目前广泛接受的催化机理是活性中心的硒醇负离子在氧化后形成亚硒酸（Selenenic Acids，Sec-SeOH），该中间体能够通过多种途径被还原为硒醇，包括与主链发生环化以及形成硫硒化物等（图1左），推动催化循环的进行。然而，亚硒酸的化学性质高度不稳定，容易发生歧化以及脱硒反应（图1，Step D），本文发表前人们仍然无法捕获或者观测到该中间体，阻碍了对GPx活性与功能的深入理解。

图2. 本文所使用的模型体系

作者课题组此前发展了一类大位阻的硒醇分子，其氧化后由于分子间的相互排斥抑制了歧化以及脱硒反应的发生，他们利用其成功地捕获到了硒醇在氧化过程中的亚硒酸中间体。但是此前的体系与蛋白结构的相似性不高，无法反映GPx在氧化过程中的真实状态，在本文中，作者将Sec引入到了该体系的中心位点，模拟了GPx活性中心的结构，并成功的通过核磁共振(NMR)捕获到了其在氧化过程中的关键中间体，为进一步认识GPx的功能奠定了基础。

图3. 两个模型体系的合成

本文设计了两个模型体系，分别是Sec模型与模拟活性GPx活性中心的三肽模型（图2），并合成了其氧化前的前体（3a, 3b）。利用过氧化氢对3a进行氧化后，发现大部分硒醇发生了脱硒反应，形成脱氢丙氨酸，并且产生了一部分二硒化物。作者推测亚硒酸对温度十分敏感，容易在室温下发生脱硒反应，因此他们在-65 °C下进行了反应并利用NMR在-20 °C对反应进行了原位观测，通过该策略他们成功地观察到了体系中有92%的3a转化为了相应的亚硒酸1a（图4），而升温后有84%的1a转化为了脱氢丙氨酸，这一现象验证了此前的推测。在低温下向1a中加入2当量的半胱氨酸能够迅速地发生还原反应产生硫硒化物，意味着小分子巯基对于亚硒酸具有极高的反应性。

图4. 在低温下对1a氧化的监测

接下来，作者对三肽模型进行了研究。同3a相似，3b在低温条件下氧化后会产生亚硒酸化合物1b。由于临近肽键的存在，在升温的过程中观察到了亚硒酸与肽键N-H脱水形成的环状产物14，同时脱氢丙氨酸的产率有所降低，该结果说明，在GPx的Sec氧化后，能够通过形成分子内环中间体，避免了脱硒反应的产生。作者进一步通过实验验证在足量硫醇还原剂的存在下1b与14均能够被还原为相应的硒醇化合物，进一步验证了此前的人们对GPx催化机理的推测。

图 5 1b在升温过程中产物成分的监测。

总结来说，作者发展了一种小分子模型体系成功地实现了对Sec氧化中间体的观测，为人们深入理解GPx的催化机理奠定了实验基础。

作者：Roy Wu    审校：XW

DOI: 10.1021/jacs.1c02383

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c02383