Angew. Chem. Int. Ed. | 绝对定量递送至胞质溶胶的药物载体
大家好，今天给大家分享一篇近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题为Absolute Quantification of Drug-Vector Delivery to the Cytosol。文章的通讯作者是来自巴黎文理研究大学居里研究所的Ludger Johannes教授及Christian Wunder教授。
大分子药物通常需要通过递送载体帮助实现跨膜递送及内涵体逃逸，最终到达胞质溶胶发挥作用。为了优化载体对大分子的递送效果，需要对成功到达胞质溶胶的载体进行准确量化。但目前的测定方法还有许多局限，例如缺乏细胞质定位特异性、灵敏度有限、不能实现绝对定量等。
因此在本文中，作者设计了灵敏且稳定的绝对定量方法Cyto-SNAP，并以模型载体进行了概念验证。
图1. Cyto-SNAP测定方法示意图
这一体系的设计基于SNAP标签和mNeonGreen组装形成的胞质捕获蛋白。如图1所示，苄基鸟嘌呤（benzylguanine，BG）修饰的载体仅在到达细胞溶胶后才与SNAP标签共价反应形成复合物。随后通过抗mNeonGreen纳米抗体对复合物进行免疫沉淀，分离标签蛋白捕获的载体，并利用偶联至载体的生物素进行ELISA定量。
作者首先构建了可稳定表达捕获蛋白SNAP-mNeonGreen的单克隆HeLa细胞系NG-SNAP。随后，通过免疫沉淀与下拉实验，作者对胞质捕获蛋白的功能进行验证，结果如图2所示。将NG-SNAP细胞裂解液与过量BG-生物素一起孵育，能够使裂解物中的SNAP-mNeonGreen完全被消耗，这反映出SNAP标签的高效反应性；将细胞裂解液与抗mNeonGreen纳米抗体孵育也获得相同的结果，这体现出可以获得完整的mNeonGreen免疫沉淀。以上实验结果为定量测定奠定了基础。
除此之外，灵敏度与线性程度是绝对定量的关键参数。作者将已知浓度的带有生物素及BG标记的载体STxB添加到NG-SNAP细胞裂解液中孵育，并进行免疫沉淀和ELISA。结果如图3所示，所获得的标准曲线在很宽的浓度范围内都是线性的，甚至可以检测低至皮摩尔级别的浓度。
接下来为了进行绝对定量，作者对BG及生物素部分的偶联进行优化，以实现每个载体上BG与生物素摩尔比为1：1。如图4 bcd所示，通过单偶联策略，BG与生物素通过不同长度的聚乙二醇连接子相连，并通过马来酰亚胺与载体进行偶联。通过实验对比，作者选择了兼具灵敏度及转运效率的偶联物。
使用这一方法，作者测定了到达NG-SNAP胞质溶胶的STxB载体的绝对数量。
综上所述，本文中，作者开发了一种灵敏、稳定的方法，可对载体的胞质递送情况进行绝对定量测定。
作者：ZRC 审校：SJL
DOI: 10.1002/anie.202102332
Link: https://doi.org/10.1002/anie.202102332