J. Am. Chem. Soc.|聚合物结构调节蛋白质胞内递送体系
大家好，今天给大家分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的研究，题为：Regulation of Proteins to the Cytosol Using Delivery Systems with Engineered Polymer Architecture。文章的通讯作者是The University of Western Australia的K. Swaminathan Iyer和University of Massachusetts Amherst的Vincent M. Rotello。
蛋白质疗法在蛋白质缺失或突变相关的疾病有着不可替代的地位，尽管近年来一些载体（如脂质体、纳米颗粒）已被开发用于蛋白质胞内递送。但蛋白质胞内递送仍存在着一些挑战：天然蛋白质难以进入细胞，常规的递送方式都是通过细胞内吞将载体和功能蛋白以内涵体形式送入细胞，但大多数蛋白会被困在内涵体中，导致蛋白降解失活；此外，细胞内蛋白质浓度的高度动态的，蛋白质会被不断的降解，往往需要新的蛋白进行持续供应，而这种长时稳定的蛋白质胞内缓释难以达成。若能调控蛋白质胞内的释放速率，则能为蛋白质疗法提供更灵活的制定方案。在本工作中，作者基于树枝状高分子聚酰胺-胺（PAMAM）的共聚物，通过对其表面进行修饰（如全氟烷基链、胍基等）改变其与蛋白质的相互作用，构建了一种简洁的内涵体释放可调控的蛋白质胞内递送平台，实现了蛋白质在内涵体中的可调控释放。
如图1所示，作者使用不同单体比例的羟乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）和环氧丙基甲基丙烯酸酯（GMA）共聚得到了三种线性无规共聚物，随后将环氧官能团转化为叠氮基（4a-c），再通过click反应引入3.5和4.5代的PAMAM（5a-c，6a-c），再进一步转化为树枝末端为氨基的4和5代PAMAM（7a-c，8a-c），得到了PAMAM功能化的甲基丙烯酸甲酯共聚物（denpols）。通过树枝末端的端基，还能进一步在PAMAM表面引入胍基和全氟烷烃链（图1b）。作者选用了带E-tag（谷氨酸标签）的mCherry蛋白（mCherry-E20）包埋进共聚体系中，mCherry-E20的分子量约33 kDa，若能成功实现胞内递送该蛋白会扩散进入细胞核给予佐证。
图1. 侧链含不同末端基团PAMAM的denpols的合成路线
首先作者探究了denpols表面基团对蛋白递送效率的影响（图2）。在a-c三种共聚骨架中，PAMAM比例最高的c显示出最好的效果；在不同的细胞模型中（图2d），末端为胍基的denpol-10c效果优于全氟烷基链的denpol-12c，平均荧光强度最高，其次为末端氨基的denpol-8c；在RAW264.7（小鼠巨噬细胞）中，全氟烷烃的疏水性可能对蛋白递送起到了辅助作用。
图2. 不同树枝末端基团denpols对蛋白递送效率的影响
随后作者探究了denpols表面基团对蛋白递送动力学的影响。作者观察了三种不同端基的denpols实验组在最初两小时内的细胞对mCherry-E20的摄取（图3a-c），结果表明末端为全氟烷烃链的denpol-12c在两小时内表现出最快的内体释放，末端氨基的denpol-8c最慢。值得一提的是三种denpols的释放呈现线性增长的趋势，这表明释放过程更像是“内涵体泄漏”而并非“内涵体溶解”。尽管三种不同端基的denpols蛋白释放速率不同，但都呈现出线性释放的动力学趋势，这表明“泄漏”释放的性质很可能来自于树枝状PAMAM本身。
图3.不同树枝末端基团denpols对蛋白释放动力学的影响
最后，作者探究了聚合物结构对内体释放速率的关系。仅用末端为氨基的球形5代PAMAM作为载体时，蛋白释放速率呈现出“爆发型”趋势（图4左），而将PAMAM修饰在线性的甲基丙烯酸甲酯共聚物骨架上后，蛋白释放速率呈现出“泄漏型”趋势（图4右）。这些结果表明，相较于较刚性的球形表面（高代PAMAM），将树枝状高分子多价连接在柔韧的线性骨架上后能增强其与内体膜间的相互作用，这种相互作用能诱发“泄漏型”释放。
图4. 左) 树枝状聚合物介导的“爆发型”蛋白释放和
右) denpols介导的“泄漏型”蛋白释放
总的来说，作者基于PAMAM制备了一种结构可调的共聚物递送体系。不同于传统PAMAM的“爆发型”释放，多价修饰的树枝状聚合物可诱导内体“泄漏型”释放蛋白，而聚合物表面的修饰也能调控蛋白释放速率（全氟烷烃链>胍基>胺基）。这些发现为设计时间控制型内涵体释放的蛋白胞内递送体系提供了思路。
作者：WG 审校：ZHS
Iyer, K. S.; Rotello, V. M. et al. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143 (12), 4758-4765.
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c00258