ACS Nano|基于聚乙二醇的模块化抗菌拟肽的设计
大家好，今天为大家推送的文献是发表于ACS Nano的一篇文章，标题为“Antimicrobial PEGtides: A Modular Poly(ethylene glycol)-Based Peptidomimetic Approach to Combat Bacteria”。本文的通讯作者为韩国高丽大学的Dong June Ahn教授，蔚山科学技术院的Robert J. Mitchell教授和延世大学的Byeong-Su Kim教授。
近年来，日益增加的细菌耐药性已成为全球公共卫生关心的问题，而抗菌肽(AMPs)则是公认的有望能解决这一全球挑战的方案。AMPs通常为由30~50个氨基酸组成的两亲性寡肽，含有的阳离子氨基酸能够与负电性的细菌膜发生相互作用；而疏水氨基酸则使得AMPs插入磷脂双分子层中，以破坏膜稳定性。此外，其刚性主链上官能团规则排列，增加其杀菌效果。然而，AMPs可扩展性较差、生产成本高，同时易被蛋白酶灭活，因而难以广泛使用。
为解决上述问题，科学家合成了一系列聚合物，用于模拟抗菌肽，但大部分为全碳主链，因此水溶性较差。而聚乙二醇(PEG)是一种具有高溶解性、高生物相容性且低免疫原性的聚合物，因此作者希望结合PEG骨架与抗菌肽的官能团，构筑得到基于PEG的拟肽(PEGtide)。
作者首先开发了一系列功能性环氧化物单体，以模拟三种氨基酸残基，具体为叠氮基丁基缩水甘油醚(ABGE)、异丁基缩水甘油醚(IBGE)和乙氧基乙基缩水甘油醚(EEGE)。上述三种单体能够通过阴离子开环聚合反应，合成聚乙二醇预聚物(图1)。此外，进一步通过脱保护与还原，能够得到了一系列主链高度柔顺、侧链受控官能化的功能性聚乙二醇。这一设计模拟了天然AMP中的关键氨基酸：赖氨酸、亮氨酸和丝氨酸，能够通过简单的方法、以较高的产率得到并提纯(图2a-d)。
接下来，作者在室温下以苄醇引发，以超强碱t-BuP4催化，进行阴离子开环聚合。通过调整单体的进料顺序与比例，进一步调节聚合物组分 (图2e)。作者调节了拟肽中各个单体的比例，例如拟肽[25.5.0]中赖氨酸/亮氨酸/丝氨酸残基数目分别为25、5、0。通过动力学实验证明了单体的竞聚率接近，能够实现无规共聚。通过脱保护和还原，即可得到期望的拟肽(图1f)。其较大的正值Zeta电势说明脱保护的完全，同时也说明材料的抗菌潜力。
作者以多种革兰氏阴性菌株和革兰氏阳性菌株评估每种拟肽的抗菌效果。对于无阳离子的拟肽，例如[0.30.0]与[0.0.30]而言，几乎没有抗菌作用。而含赖氨酸部分的拟肽[25.5.0]的最小抑菌浓度(MIC)为1.01 uM，和其他活性抗菌肽相当(图3a)。
图3. 拟肽的抗菌活性、溶血活性与稳定性
考虑其作为伤口敷料的潜在应用，作者评估了材料的血液相容性和稳定性。随着疏水部分的增加，材料的溶血活性HC50增加，即具有非特异性的生物毒性。作者以HC50/MIC评价材料的选择性，发现拟肽[25.5.0]选择性高达64，甚至优于麦角皂苷衍生物(9.6)(图3b)。此外，该材料也具有优异的稳定性，在70 ℃高温与1M HCl的酸性条件下能够保持稳定，同时在胰蛋白酶或蛋白酶K处理后抗菌活性并未减弱。
如图3c所示，暴露于拟肽[25.5.0]下的大肠杆菌出现膜破裂行为。作者通过量化拟肽处理前后ATP含量，证明该拟肽的抗菌原理是扰动细胞膜。同时，由于革兰氏阴性菌存在的脂多糖(LPS)结构会抵抗外界刺激产生适应性变化，作者对不同LPS长度的大肠杆菌突变体进行测试，证明拟肽[25.5.0]对不同LPS长度的突变体均具有较好的杀灭效果(图3d)。
进一步，作者研究了聚合物结构对抗菌肽功效的影响，发现嵌段结构的拟肽相比于无规共聚物具有更差的选择性。作者认为，嵌段结构中集中的阳离子和疏水部分使得其更易与人红血球(RBC)细胞膜发生多价相互作用，而无规共聚物则通过单体的分散而减轻。作者通过CG-MD模拟研究了这一点(图4)。嵌段拟肽在2 us内即形成了较大的聚合物簇结构，而无规共聚的拟肽则仍为单分散的聚合物链段。模拟结果表明，对于大肠杆菌细胞膜而言，两者无明显差异。而对于RBC膜而言，无规共聚物在200 ns内有17种结构结合在膜表面，13种保留于水中；而嵌段共聚物有27种结构和膜结合，并会进一步形成脂质突起。暴露于嵌段共聚物拟肽下的RBC膜主要成分N-硬脂酰-D-鞘磷脂(DPSM)的尾部平均有序度降低更多，证明对RBC膜仍有较高的相互作用。结合过程中自由能的变化进一步支持了该结论。
综上，本文设计了一种新型的功能化聚乙二醇，以模拟天然抗菌肽的关键氨基酸残基。得到的拟肽对多种细菌菌株有较好的杀灭效果，同时特定组成的拟肽能够具有较好的选择性。同时运用粗粒分子动力学解释了嵌段共聚物和无规混聚物的选择性差异。作者期望将上述方法用于开发更有效的抗菌聚合物。
作者：ZZC 审校：LJH
DOI: 10.1021/acsnano.1c02644
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c02644