动态资讯Day 1 | 2018 Nanopore科研团体大会

一场Nanopore科研和摇滚的混合盛宴。

全体会议

直接从微生物组群中生成完整的微生物基因组

Ami Bhatt——斯坦福大学医学（血液学）和遗传学助理教授。她的团队利用纳米孔测序从复杂的微生物群落中实现了完整基因组的组装。除了了解微生物致病性外，Ami还特别关注微生物如何影响癌症或心脏病患者的预后。

人体含有大约10万亿个微生物。微生物的数量、种类和复杂性，以及高水平的宿主DNA，使对人类微生物组的准确基因组分析极具挑战性。这种情况限制了我们对基因内容和调控的理解。

无需分离而直接从复杂的微生物群落中恢复大量完整的基因组，长时间以来一直是宏基因组研究中的热门。Ami展示了一种新的工作流程，来使用纳米孔长读长测序实现这一目标。该工作流程包括优化的高分子量DNA提取方法、纳米孔长读长测序、组装和共有序列精化步骤。

为了从人类宏基因组样本中生成完整基因组装配，斯坦福大学的团队评估了许多方法，包括使用Chromium平台结合定制的组装平台Athena的新型DNA分区方法。在实践中，一些微生物物种的基因组组装良好，具有高contig N50值。然而，其他类型的微生物，如普氏菌(Prevotella spp）组装不佳。普氏菌是坦桑尼亚Hadza社区肠道微生物组的主要成分。Ami表示，对于4800x的覆盖度，测序深度不是导致组装不佳的问题，问题是在于这些物种中发现的高水平的基因组重复。

Ami描述了她实验室的研究生Eli Moss是如何使用长读纳米孔测序来提供更完整的基因组组装的。一开始，Ami质疑从粪便样本中获取高分子量DNA的挑战，拒绝了他的提议。但Eli没有被吓倒，他花费了6个月的时间，测试并优化了各种样品制备方法。Ami幽默地称之为“一项不是非常令人愉快的任务”。但他的毅力最终得到了回报。他的技术包括酶细胞壁降解，苯酚:仿提取，重力柱纯化和基于磁珠的片段分选，同时提供了适合产生长测序读长的产量和分子量。

在采用快速测序试剂盒制备文库后，使用MinION对DNA进行测序。他们评估了许多装配工具，发现Flye和Canu提供的结果最佳。这两种工具都允许将高重复性的普氏菌（Prevotella copri）基因组组装成3.8 Mb的单一contig。Ami将这个结果描述为“惊人”，这不仅取决于粪便样品的宏基因组测序本身就是一项重大挑战，它还代表了第一个全长的P. copri基因组。该基因组显着改善了先前基于短读长的组装。

Ami在总结演讲时评论说，他们的方法代表了一种有效、直接的解决方案，可以对肠道微生物组内结构复杂的细菌基因组进行全面有效的从头表征。团队现在计划从宏基因组数据中组装更多的微生物基因组，并分析数据探索甲基化（在原始纳米孔测序数据中作为标准提供）用以预测质粒-染色体配对。

全体会议

无需组装：从自然发生的微生物群落DNA中使用单条纳米孔读长生成完整的病毒基因组序列

Edward DeLong现任夏威夷大学海洋学教授，并担任微生物海洋学研究与教育中心（C-MORE）和Simons海洋过程与生态学协作（SCOPE）的联合主任。

DeLong的科学兴趣主要集中于海洋微生物基因组学、生物地球化学、生态学和进化，致力于研究海洋中的微生物，将基于现场的方法与基因组技术相结合。

病毒是海洋生态系统中最丰富的组成部分，大约一茶匙的海水中就含有1百万微生物和1千万病毒。病毒是营养循环、基因侧向转移和遗传多样性的重要媒介。海洋噬菌体通过细胞裂解生成营养物质和感染等因素来影响、维持和改变原核种群。由于噬菌体和原核海洋种群的相互关联性，我们不仅要了解海水中存在哪些噬菌体类群，还需要了解这些种群如何在环境和时间梯度上发生变化，这对于了解环境条件的变化如何改变生态系统功能非常重要。

尽管最近的宏基因组分析对自然发生的病毒多样性的提供了新的见解，但从宏基因组学的短读长组装中获得全长病毒基因组仍然具有挑战性，尤其是在缺乏良好的病毒参考基因组时。

为此，DeLong团队开发了一系列的实验方案，结合谨慎的DNA分离，以及生物信息学过滤和分箱（binning）过程，使用单个纳米孔读长，从天然海洋种群中产生了许多不同的和多样的全长噬菌体病毒基因组。

使用阿罗哈地区15ml海水，或200ul病毒浓缩液（从117-250ml海水中提取）生成2-5ug DNA，他们以1ug DNA起始量，采用Nanopore连接测序试剂盒LSK109进行文库制备；然后使用R9.4.1测序芯片在GridION上对样本进行测序。

测序完成后，Delong利用Kaiju注释工具，对MinION产生的1D读长进行了宏基因组分箱（binning）来产生已知病毒的分类箱，以及除去已知的非病毒生物序列。DeLong接着对Kmer bins进行了更进一步的分箱水平分析：首先使用Canu对读长进行错误校正后，鉴定横跨基因组的读长，接着使用PyANI根据平均碱基鉴定读长集合簇，然后使用Racon和Nanopolish处理每一个集合簇的读长，从而得到噬菌体草图基因组。

为了验证这些草图病毒基因组，他们进行了许多检查。使用名为Virsorter的程序来确定每个集合簇中有多少读长被预测为病毒来源，结果显示100％一致性。此外，95％的polish读数具有200-2000bp的末端重复序列，这在病毒基因组中非常常见。

将已知海洋噬菌体的脉冲场凝胶电泳与可疑噬菌体分箱的读长长度分布进行比较，经polish的读长长度匹配准确，表明整个病毒基因组实际上已在单个纳米孔读数中捕获。在三个样本中还检测到了许多新的病毒基因组，虽然与已知病毒基因组的同源性很低，但它们具有完整噬菌体基因组的许多特征。

Delong表明，

“

未知来源的噬菌体基因组的比例随海洋深度增加。在完全相同的样品上比较短读长和纳米孔测序读长， Nanopore读长可非常有效地分析稀有噬菌体类型。

”

分组会议——临床微生物学

通过猪-人界面进行甲型流感病毒现场监测来减轻大流行风险

Matthew Keller博士来自美国疾病预防控制中心，他的团队目前正在使用Oxford Nanopore的MinION设备开发快速、便携、端到端甲型流感病毒测序管道。他近期在Scientific Reports期刊发表了题为“Direct RNA sequencing of the coding complete influenza A virus genome”的工作，描述了首个以RNA原始形式对其基因组进行的测序。

季节性流感每年导致350万人患病，29-65万人死亡。在流感病毒中，以甲型流感病毒变异最为频繁，其遗传物质为单股负链RNA。病毒粒子基本上是独一无二的，它能够通过抗原转变进行快速突变，产生没有疫苗的新毒株。

病毒可以从动物传播到人类宿主，并可能引起大流行。导致死亡人数超过第一次世界大战的西班牙流感病毒是从野生水禽转移到人类，而2009年H1N1爆发是则由三种物种中的四种病毒引起，其中猪作为“混合载体”。

随着从猪到人类的人畜共患病转移成为潜在大流行病的重要来源，猪与人接触界面会在哪里发生？答案之一是展览猪展示。猪和人类从远方进行调运，两者之间有很多接触，这些都可能造成人畜共患病风险。

因此，进行猪甲型流感病毒爆发的基因组分析，以便准确预测即将流行的病毒亚型，有针对性地实施预防性疫苗接种至关重要。

为了实现更快的现场测序，Matthew Keller团队开发并部署了使用MinION快速便携的甲型流感病毒测序流程，并将其称之为移动流感分析MIA（Mobile Influenza Analysis）。

搭乘飞机，团队使用两个小手提箱和一个冷藏箱将MIA带到了一个大型猪展，在那里，病猪和传播无处不在。Matthew幽默的表示，用于分析的高功率笔记本电脑实际上是测试管道中最不便携的部分。在抵达后的周四设置MIA后，他们对100头猪进行了快速测试筛查，然后在周五对呈筛查阳性的7头猪和他们的邻居取鼻拭子。

在周五，研究小组对甲型流感病毒基因组进行了RNA提取(30分钟)——RT-PCR扩增(1.5小时)——条形码添加和文库制备(1.5小时)——纳米孔测序(1-6小时)——边测序边分析数据(1-12小时)。同日下午，他们已经能报告每个条形码样本的病毒覆盖率，并构建样本中鉴定的13种甲型流感病毒的系统发育树。其中包括一个A(H1N1)，一个A(H3N2)和11个(H1N2)H1δ2甲型流感病毒。

将结果与疫苗进行对比之后，团队发现H1N2δ2病毒谱系的现场分析显示与目前的候选疫苗不匹配，并将结果通过电子邮件发送给了疾控中心，以便在拆包实验室设备后的约18小时内将其用于开发合成候选疫苗。

比较测序周期显示，MinION 18小时（未经优化）vs. 超过36小时短读长测序。在24个样本的13个中，Nanopore测序的序列一致性准确度达99.3%，覆盖度ct<30。

USDA的合作者构建了后续系统发育树，允许跟踪猪H1N2δ2的进化直至能够被检测到。自研究以来，已发现2例人类H1N2病例，其编码与猪的位置相符，菌株与MIA鉴定的菌株相匹配。

Matthew希望通过对甲型流感病毒的快速基因组表征，在爆发期间提供关于病毒谱系、RNA区段重配和哺乳动物/人类适应特征的及时信息。基因组数据还可用于推断抗原特征，识别新出现的病毒来自何处/何时，并识别传播链，从而有助于控制新出现的甲型流感病毒威胁。

分组会议——临床微生物学

新兴病毒“热点”地区的纳米孔测序——非洲猪瘟和乌克兰的禽流感

Ganna Kovalenko博士是乌克兰国家农业科学院（IVM NAAS）兽医学研究所动物疾病诊断实验室的研究员，从事人畜共患病的监测，以及新出现病毒的测序分析，包括非洲猪瘟和高致病性禽流感。她是乌克兰四个科学机构与阿拉斯加大学进行国际合作的关键学者，利用MinION建立乌克兰对新出现的病原体进行基因分型的能力。

新出现的病毒通常利用新兴的生态区位感染新的宿主物种。动物中的病毒流行病（人畜共患病）高度依赖于动物群体之间的相互影响，以实现持续的病毒传播。

非洲猪瘟病毒是一种感染家猪和野猪的急性、出血性、烈性传染病。非洲猪瘟病毒是一种大型双链DNA病毒，长约170-190kb，包含超过150个基因，这在病毒中已属非常巨大。非洲猪瘟存在24种基因型。

目前尚无针对非洲猪瘟病毒的有效疫苗和抗病毒药物。了解病毒基因组，是研发潜在有效疫苗的关键。为此，Ganna Kovalenko开发了全基因组纳米孔测序方案，来研究最近在乌克兰出现的两种致死病原体的遗传特征。

他们首先对乌克兰猪瘟病毒测序：从感染猪瘟的家猪血液的临床样本中提取DNA；采用快速测序试剂盒进行快速文库制备；接着使用MinION和MIN106测序芯片实施测序运行。在数据分析中，他们利用Albacore进行碱基识别；Porechop去除接头；Minimap2进行参考基因组比对；以及Nanopolish进行变体识别。

测序获得了2Gb数据，超过55万条读长，平均读长长度为约4kb。其中1290条读长比对到长约189kb的参考基因组ASFV/Georgia/2007/1，覆盖度为30x。

接着他们着手于测序乌克兰禽流感RNA病毒。禽流感病毒由野鸟携带，可导致家禽中致命的高致病性爆发。在田间收集了超过7,500个样本后，初始的PCR的测试表明存在禽流感H5或H7亚型。

自环境样品以及来自家禽和野生水禽的尸检组织提取病毒RNA，经逆转录并通过MS-RTPCR扩增生成cDNA文库，接着进行条形码标记并在MinION上进行1D测序，通过Geneious R11组装病毒基因组的八个区段中的每一个。Ganna展示了欧亚LPAIV基因与一个带条形码标签的样本的比对，显示与参考基因组呈99％一致性，从而揭示了乌克兰病毒的起源。

使用MinION技术，Ganna的研究小组首次在乌克兰测序了完整的189kbp非洲猪瘟病毒（ASFV）和禽流感基因组。他们开发了扩增子panel用于现场基因分型和流行追踪，以揭示非洲猪瘟病毒在猪和野猪中传播的神秘面纱。同样，通过RT-PCR、条形码添加和测序，他们扩增了来自家养鸡和野鸭的高致病性H5禽流感病毒的多片段RNA基因组和缺损干扰RNA（defective-interfering RNA）种系，揭示了乌克兰的禽流感病毒的起源。

分组会议——临床微生物学

MinION全基因组测序疟疾野外分离株 

Alyssa Barry是Walter & Eliza Hall医学研究所人口健康与免疫部门的实验室负责人，也是墨尔本大学的副教授。Alyssa的研究揭示了疟疾寄生虫进化、传播模式、抗药性和疫苗的主要见解，在疟疾流行国家的控制和消除工作中发挥关键作用。

疟疾每年可导致429,000人死亡，2.12亿临床感染病例。自2000年以来，控制疟疾的全球性努力使得疟疾病例和死亡人数减少了50％。此前疟疾肆虐的17个国家，更是自2010年以来便宣布完全消灭了疟疾。

然而，现在这一进展已经停摆，疟疾在91个国家仍然流行，许多人此刻正遭受疟疾复发。缺乏资金和医疗基础设施薄弱意味着这些国家中只有一半正在走上正轨。

消除疟疾的挑战包括识别较小的、成群的、有时无症状的感染，以及新的流行病和耐药菌株的增加。

Alyssa介绍了将MinION设备用于疟疾基因组流行病学的好处，描述了便携式实时技术如何在不到三小时内实现多重暴发监测和耐药性分型。长读长可实现全基因组组装，跨越高复杂性区域并解析大型结构变体。在不到3小时内便通过LAMP对恶性疟原虫分离株Pfk13进行基因分型，并使用长扩增子鉴定了9种耐药基因。

Alyssa和她的团队使用1D连接测序试剂盒（SQK_LSK108）制备了两个恶性疟原虫实验室分离株——Xha_k和BB12的DNA文库，并在MinION上测序。通过Albacore进行读长碱基识别，NanoPLOT进行质量检查，Porechop进行接头修剪，并通过Minimap进行比对。

结果生成了30x的覆盖度,分别覆盖96%的Xha K和95%的BB12。100％DNA比对代表为寄生虫而不是宿主DNA。通过Canu实现从头组装，使用nanopolish进行处理，通过nucmer将contigs与3D7参考分离株比对。Xha组装自15个contigs，平均覆盖度为75x。BB12组装自17个contigs，平均覆盖度为106x。

Alyssa描述了一名入住皇家墨尔本医院的病人。在诊断出临床疟疾后，患者接受了苯芴醇治疗并返回家中。一个月后复发返回医院。取血液进行DNA分析，患者再次接受治疗后出院回家。为了研究第二次感染是由同一个克隆引起，还是代表第一次治疗后出现了耐药性克隆，该团队使用了他们的快速测序工作流程。使用来自血液样品的DNA在MinION上测序，在45分钟内便产生了足够的数据，覆盖度是恶性疟原虫基因组的5倍。

尽管恶性疟原虫是单倍体，但比对数据的分析显示了高比例的杂合位点；随后对高度多态性区域的分析表明其存在两种不同的单倍型。随后鉴定出其实是对苯芴醇而非青蒿素耐药，表明延迟治疗失败是由于伴侣药物耐药性的结果。Alyssa强调了这种快速测序测试可在患者随访和个性化治疗中产生显着效果。

Alyssa总结说，

“

使用MinION可以实现快速疟疾寄生虫基因组测序和全基因组组装，长读长允许解析复杂区域，产生参考基因组并确定结构变体和抗药性标记。

”

科研团体大会还邀请所有参会的科学家们共赴独具一格的社交晚宴，给你不一样的学术体验。

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