实时的微生物鉴定和抗微生物药物耐药性分析

微生物是地球上最丰富、最多样的生命形态。在健康、疾病和许多工业过程中发挥着至关重要的作用。

传统的微生物研究方式是采用人工培养基培养单个物种或菌株。然而，在目前分类的1000万个物种中，经过实验室培养的只有0.1％。现代测序技术的出现能够对已培养的、更重要的是对未培养的微生物进行高通量基因组分析，大幅提高了我们鉴定和表征微生物的能力。

图 1.  微生物有七种主要类型： (a) 细菌（例如结核分枝杆菌)； (b) 古生菌（例如詹氏甲烷球菌)； (c) 病毒（例如单纯疱疹病毒)； (d) 真菌（例如酿酒酵母)； (e) 寄生虫（例如粪类圆线虫)； (f) 原生动物（例如草履虫)； (g) 藻类（例如美丽团藻）。

在微生物中，重复区域和结构变异体起着重要作用，其中包括抗菌素耐药性和毒力因子的发展和传播。然而，用于产生大多数现有参考基因组的短读长测序技术难以对这些区域进行解析 (图2)。因此大多数参考基因组并不完整，在无法测序或者无法比对的区域存在着空白。相比之下，长测序读长更大的优势是在于它们在读长之间具有更大的重叠区，从而更容易将DNA 片段组装成正确的顺序。如果你把这想象成一个拼图，拼图块越大，拼图就越容易。

图2. 长读长在重复区域从头组装中的优势

使用Oxford Nanopore提供的“WIMP-ARMA”分析工作流程进行实时微生物鉴定和抗微生物药物耐药性分析，可将测序读长与综合抗生素耐药性数据库(CARD)进行比对，并提供报告，突出显示能够表明给定抗生素的耐药性的比对。由于不需要全面深入的生物信息学专业知识，直观的WIMP-ARMA工作流 程允许任何研究人员在其样本中对抗菌素耐药性进行鉴定。

使用传统的培养法，研究人员鉴定结核病致病微生物——牛型结核分枝杆菌抗菌素耐药性的时间为8-15周，使用纳米孔测序技术能够将这一时间缩短至仅12小时。利用超长读长和实时分析，纳米孔测序已可以在一系列病原体中实现快速耐药性分析，包括细菌、病毒和真菌。

同时，纳米孔测序不需要扩增或链合成，这意味着可以在同一测序运行中实时检测碱基及其修饰。碱基修饰可见于几乎所有研究的微生物中（例如, 5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤N6-甲基化)，但许多修饰碱基的具体作用尚未被完全阐明。迄今为止，研究人员利用纳米孔 测序技术检测了许多修饰碱基，包括假尿苷、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基胞 嘧啶(5mC)和7-甲基鸟苷(m7G)。

实际案例1

人疱疹病毒1型（HHV-1）耐药性

的从头组装和表征

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这项研究证明纳米孔测序能够改善病毒基因组的无参照从头组装，并且可以跨越短读长测序中造成contigs连接片段中断的重复元件。

”

普通人群中约有60-90％感染人类疱疹病毒 1型(HHV-1)。 尽管大多数呈无症状感染, 仍有高达45％的人群患有复发性口唇疱疹。目前许多药物可用于治疗HHV-1感染，但它们都容易产生耐药突变。

HHV-1是一种大型双链 DNA病毒，长约152 kb。由于它基因组结构复杂，且富含GC ，使得在技术上采用短读长测序数据组装HHV-1全基因组具有一定挑战。为了提高对HHV-1基因组的组装和分析，进行耐药突变的鉴定，英国牛津大学和英国英格兰公共卫生部门的研究人员将长读长纳米孔测序数据与短读长测序平台中获取的数据相结合，对18个接受抗病毒治疗的免疫受损患者，收集了经培养的HHV-1样本进行测序，并使用MIRA48 和LINKS49工具进行了基因组组装。

纳米孔读长的长度使得现有的因重复元件而被打断的短读长contigs能够被合并，生成改进后的基因组组装，如证据所示，所需contigs数量减少，以及N50值提高 (表1)。 该小组对包括重复、删除和重排在内的结构变异的区域进行了鉴定。他们在基因UL23 中发现了高水平的核苷酸变异，其中大部分耐药性突变都发生在该基因中。研究人员认为，这些变异很可能是在样本采集之前进行的抗病毒治疗期间出现的。 

表1. 将纳米孔长读数据结合到现有的短读长数据中可提高基因组组装。这里显示的是来自单个 HHV-1样本（p1A_454）的数据。

实际案例2

快速质粒测序和抗性基因检测

多重耐药菌对全球公众健康的威胁正日趋严重。许多抗菌素耐药性基因都是位于质粒上。然而，传统的短读长技术在对质粒进行测序时会受到高度重复DNA片段的影响。加上细菌质粒长度可跨越数十万的碱基，进一步增加了精确组装的复杂程度。

应用短读长方法产生的质粒组装体不完整、且片段化，常常无法与基因组序列区分开。了解抗微生物药物耐药性基因 (即质粒或基因组）的位置能够为流行病学追踪提供信息，并为抗生素耐药性发生的进 化和传播机制提供新的见解。

美国国立卫生研究院的研究人员现正应用纳米孔测序技术改进质粒组装，以进行快速的抗微生物药物耐药性鉴定。该小组首先使用一个连接测序建库试剂盒 (Oxford Nanopore）对已经过充分表征的碳青霉烯抗性肺炎克雷伯菌分离株的质粒DNA进行测序。长纳米孔读长的组装的一致性准确度达99％。 通过对短读长技术获得的读长进行处理后，准确度提高到99.9％。研究人员表示，对于潜在的未来临床应用，纳米孔测序具有更快速的周转时间。

图3. 利用不同的菌株，在三次测序运行中获得5000个纳米孔读长所需的时间量。使 用基于转座酶的快速测序试剂盒（用于测序KPESBL-1肺炎克雷伯菌)，相比使用连接测序试剂盒（用于测序 ECESBL-1大肠杆菌和KPNIH11 肺炎克雷伯菌分离株)，能更快的产生数据。

实际案例3

RNA病毒基因组的快速测序

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cDNA测序提供的灵敏度和PCR法相当，而直接RNA测序提供了最快的样本到结果周转时间，没有扩增或逆转录偏差。

”

肠道病毒 (EV）是一种单链RNA病毒，每年可造成全球数百万人感染。感染引起的临床表现范围很广，可从良性咽喉痛到更为严重的支气管炎和肺。

基于PCR的检测是常规鉴定具有临床价值的病毒最常用的方法。然而，在使用此类技术时，病毒基因组中经常出现的点突变和重组事件有可能导致出现假阴性结果。此外，目前的检测技术需要首先对病毒进行培养，这通常需要5-10 天的时间，大大延迟了获得结果的时间。

为了克服这些难题，瑞士伯尔尼大学的Alban Ramette博士及其小组评估了使用纳米孔 cDNA和直接RNA测序从临床研究样本中获取完整的肠道病毒基因组序列的能力。 研究表明，使用来自培养的病毒cDNA样本，在开始测序运行的几分钟内便可获得98.8％的序列一致性准确度。使用nanopolish工具处理序列，精确度随后能提高到99.8％（图4)。

不需要逆转录或扩增的RNA直接测序，在例如病原体鉴定之类时间要求严格的应用中尤为有用。伯尔尼大学用于RNA直接测序的样本制备方法只用 5.5个小时，而cDNA方法需要23个小时。 为了进一步简化该过程，研究人员从粪便样品中获取了RNA直接测序的样本，没有预先进行病毒培养。尽管样本制备方法仅产生了140ng的 RNA，与推荐的500ng起始量相差甚远，但该小组根据11个读长 (长度通常大于1000个碱基）测序并组装出了完整的柯萨奇病毒 (Coxsackievirus）基因组。他们的研究显示，一条含有7208个碱基的单一读长几乎覆盖了整个基因组，与参照柯萨奇病毒基因组序列相比，仅在序列的5’和3’末端少了25和109个碱基。

图 4. 使用纳米孔技术，对培养的柯萨奇病毒 (Coxsackievirus）分离株中获得的cDNA进行测序。

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