NGS测序原理梳理02-簇生成

 flow cell

为何要先介绍flow cell？

因为簇生成的过程发生在flow cell上。

flow cell简介

1）flow cell是一个玻璃片，上面有2个或8个泳道(lane)，有一元硬币那么厚，不同测序仪使用的flow cell可能不同，下图为一个8 lane flow cell。

不同平台可能对应不同的flow cell，如下：

2）flow cell表面都随机植入了大量与文库P5互补的序列及P7，如下图：

3）后面要介绍的簇生成和测序均发生在Lane里面；

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 2 簇生成步骤

为何要进行簇生成？

单个DNA文库序列释放荧光信号太弱，不容易被检测到；多个拷贝的簇DNA文库序列可以放大荧光信号，可以理解为一个簇对应fastq中一条read。

簇生成步骤

1）文库与flow cell表面P5杂交与互补链合成；

• 文库与flow cell表面P5杂交

• DNA聚合酶作用下从3'到5'延伸合成互补链

• 互补链合成

 2）双链变性；

• 双链变性洗脱文库

• 留下新合成的单链

3）桥式PCR扩增；

• 第一轮扩增

• 沿着箭头方向延伸扩增

• 桥式PCR扩增 形成双链的“桥”

• 桥式双链DNA结构变性成两条分别和flow cell共价连接的链

• 第二轮桥式PCR扩增 

• 杂交

•  沿着箭头方向延伸 

•  结束第二轮PCR

•  桥式PCR N个循环后 

• 多个桥变性

4）反链切除

留下与Flow cell上P7上的链

5）DNA链3'封闭

3’端被封闭，防止不必要的DNA延伸，簇生成到此结束。

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参考资料

https://www.bilibili.com/video/BV1BW411a7Pt/?spm_id_from=333.788.videocard.1

https://www.bilibili.com/video/BV15s411t7SJ

Goodwin S , Mcpherson J D , Mccombie W R . Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies[J]. Nature Reviews Genetics, 2016, 17(6):333-351.

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