▲第一作者：刘航航 ；通讯作者：李桢教授
通讯单位：苏州大学
论文DOI：10.1021/jacs.0c09390
本文构建了细胞膜包覆、靶向小胶质细胞、具有多种类酶活性的超小纳米探针，通过清除脑部活性氧调控小胶质细胞表型，缓解脑部氧化应激及改善炎症环境，实现帕金森疾病的治疗。我们首先通过超小Cu2−xSe纳米颗粒表面的Cu2+离子络合槲皮素（简写为CSPQ纳米颗粒），赋予纳米颗粒类过氧化氢酶（CAT）、类过氧化物酶（POD）和类超氧化物歧化酶（SOD）的性质，实现优于单一槲皮素和单一Cu2−xSe纳米颗粒的ROS清除能力。更优的多种类酶活性使CSPQ纳米颗粒具有优异的抗炎作用，可以将小胶质细胞极化为具有神经保护作用的M2表型。
其次，我们采用神经元细胞（MES23.5细胞）的细胞膜包覆CSPQ，赋予其优异的靶向小胶质细胞的性能，并揭示优异靶向性能是由于神经元细胞膜表面的血管内皮细胞黏附分子VCAM-1和小胶质细胞表面的整合素α4β1之间的特异性相互作用。最后，我们利用聚焦超声打开血脑屏障将超小纳米颗粒高效递送至脑部、改善氧化应激和炎症反应，显著提高帕金森模型小鼠的学习和认知功能。
帕金森病（PD）是第二大最常见的主要中枢神经退行性疾病，在老年人中尤为常见。近年来，国内帕金森病患病率逐年上升，患者在发病后期多会出现不同程度的致残，已成为严重的经济和社会负担。PD的临床治疗主要依赖于化学药物（例如多巴胺能药物、抗胆碱药、谷氨酸拮抗剂）。但是，化学药物治疗只能缓解患者的症状，不能完全阻止疾病的进展。帕金森病主要是由于中脑黑质多巴胺能神经元变性死亡、路易小体（主要成分为磷酸化的α-突触核蛋白）形成造成的，其发病机制主要包括氧化应激，神经炎症，线粒体功能障碍，蛋白质错误折叠等。小胶质细胞作为脑部重要的免疫防线，监督和维持着脑部氧化和抗氧化之间的平衡。打破这种平衡会导致过多的活性氧（ROS）积聚，过度激活小胶质细胞，促使其分泌促炎因子、加剧炎症，从而导致神经元细胞凋亡和神经功能异常。因此，小胶质细胞可能是治疗各种神经退行性疾病的重要靶标。小胶质细胞与ROS之间的相互关系表明，消除过量的ROS可以调节小胶质细胞的过度活化并减轻对神经元的氧化损伤，从而提高PD的治疗效果。通常采用酶促和非酶促抗氧化剂来消除ROS。随着帕金森病的发展，内源性的抗氧化酶数量和活性逐渐降低，将外源性抗氧化酶高效递送至大脑黑质和纹状体已成为一种重要策略。近年来，具有类酶活性的人工合成纳米材料屡见不鲜，并被用于治疗脑缺血、脑损伤等疾病。在前期工作之中，我们构建了“富含空位”的超小Cu2-xSe纳米颗粒。“空位”使得它们在近红外一区及二区（NIR I及NIR II）具有较强的吸收，可以将近红外光高效地转化为热，用于肿瘤的光声成像和光热治疗（Adv. Mater. 2016, 28, 8927-8936；Adv. Mater. 2016, 28, 5072-5079）。此外，空位还为提高纳米颗粒诊疗效果提供了广阔的调控空间（ACS Nano, 2019, 13, 1342-1353; ACS Nano, 2017, 11, 5633-5645; ACS Appl. Mater. Interfaces, 2020, 12, 4231-4240; Nanoscale, 2018, 10, 3130-3143）。在“富含空位”的纳米材料中，超小Cu2-xSe纳米颗粒与较大的Cu2-xSe相比，具有穿越血脑屏障的优势，展现出优异的生物可降解性和良好的生物相容性（Nano Lett, 2018, 18, 4985-4992）。不仅如此，Cu2-xSe纳米颗粒具有类过氧化氢酶作用，与肿瘤内的H2O2通过类芬顿反应产生O2及ROS，实现光动力和化学动力治疗肿瘤（Nanoscale, 2019, 11, 7600-7608; ACS Appl. Mater. Interfaces 2019, 11, 16367-16379; Nanoscale, 2019, 11, 11819-11829），治疗效果可以通过增加肿瘤部位纳米颗粒的富集和H2O2含量来进一步提高（Adv. Funct. Mater. 2020, 1906128）。在上述研究基础之上，我们希望通过表面改性，制备出具有多种类酶活性、能够高效清除ROS的超小Cu2-xSe纳米颗粒。前期实验表明肿瘤细胞膜的同源靶向性可以增加肿瘤细胞对纳米颗粒的摄取，从而降低对正常细胞的损伤，提高对肿瘤细胞的杀伤作用。我们拟采用同样的策略迷惑小胶质细胞，降低其对纳米颗粒的清除，提高神经退行性疾病的治疗效果。小胶质细胞作为脑部非常重要的免疫细胞，在帕金森疾病的发生和发展过程中起到至关重要的作用。我们围绕小胶质细胞在帕金森病中的重要作用，设计构建了细胞膜包覆、靶向小胶质细胞、具有多种类酶活性的超小纳米颗粒（CSPQ@CM），利用聚焦超声打开血脑屏障，实现其靶向高效递送，并利用光声成像监测血脑屏障开启和评价递送效果。通过高效清除脑组织中ROS将小胶质细胞极化为具有神经保护作用的M2表型，有效抑制了小胶质细胞产生的炎症反应，从而提高帕金森病的治疗效果。如图一所示，我们利用超小Cu2-xSe纳米颗粒表面的Cu2+离子络合槲皮素，制备了具有高效清除ROS能力的CSPQ纳米颗粒，其清除能力优于单纯的槲皮素（QP）和Cu2-xSe纳米颗粒（CSP）。酶活性检测试剂盒证明所得CSPQ纳米颗粒通过多种类酶活性（CAT、SOD、 POD酶）清除ROS。▲图一：a）纳米颗粒（CSPQ）制备示意图；b）CSPQ的透射电镜；c）紫外吸收；d）DCFH-DA检测ROS清除能力；e-f）TA检测·OH自由基清除能力；g-h）SOD酶活性检测；i）POD酶活性检测。
如图二所示，我们检测了CSPQ纳米颗粒对细胞微环境的调控作用，以及对细胞的保护作用机制。CSPQ纳米颗粒被吞入细胞后，对BV2和3T3、以及SH-SY5Y细胞均表现出较低的毒性，并且可以有效清除小胶质细胞BV2中的ROS，明显改善SH-SY5Y细胞的膜电位和形态。利用流式分析和免疫荧光方法，我们发现CSPQ纳米颗粒可以将小胶质细胞BV2极化为对神经具有保护作用的M2表型，抑制促炎因子IL-6的释放，同时促进抗炎因子IL-10的释放。纳米颗粒还使SH-SY5Y细胞的抗凋亡因子Bcl-2表达上调，促凋亡因子caspase-3表达下调。▲图二：a）细胞吞噬CSPQ纳米颗粒示意图；b）CSPQ纳米颗粒对BV2、NIH-3T3、SH-SY5Y细胞的细胞毒性；c）CSPQ纳米颗粒在BV2细胞中的自由基清除能力；d-e）CSPQ纳米颗粒对SHSY-5Y细胞的膜电位和形态影响；f-g）流式细胞分析和免疫荧光检测CSPQ处理之后，BV2细胞被极化为M2的标志物CD206的变化；h-i）Elisa检测CSPQ处理BV2细胞后，培养基中炎症因子IL-6和抗炎因子IL-10的表达；j-k）免疫荧光检测CSPQ纳米颗粒处理之后，SH-SY5Y细胞中抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子caspase-3的表达。
▲图三：a）细胞膜包裹CSPQ纳米颗粒的示意图；b）包裹后纳米颗粒的透射电镜图片；c）SDS-PAGE分析；d-e）包裹后的细胞吞噬和量化分析；f-g）小胶质细胞表面整合素α4的表达和量化分析；h）MES23.5细胞表面VCAM-1的表达；i）ICP-MS检测小胶质细胞对CSPQ@CM纳米材料的吞噬。
如图三所示，为了提高CSPQ纳米颗粒的递送效率和治疗效果，我们提取神经元细胞MES23.5的细胞膜，包覆CSPQ纳米颗粒。发现细胞膜包裹明显增加了小胶质细胞对CSPQ纳米颗粒的吞噬，具有显著的靶向性，其靶向作用是由于小胶质细胞表面高表达的整合素α4β1与神经元细胞MES23.5表面的血管细胞黏附分子VCAM-1之间的特异性相互作用。▲图四：a）聚焦超声打开血脑屏障递送纳米颗粒的示意图；b）CSPQ@CM纳米颗粒的体外光声成像性能；c）光声成像探究聚焦超声打开血脑屏障和未打开情况下，经尾静脉注射CSPQ@CM纳米颗粒后在脑部富集的情况。
由于Cu2-xSe纳米颗粒在近红外区具有很强的表面等离子体共振吸收，可以高效地将近红外光转化为热实现光声成像，因此，我们利用光声成像监测CSPQ@CM纳米颗粒在脑部的富集效果，发现与没有聚焦超声相比，采用聚焦超声打开血脑屏障可以显著提高纳米颗粒在脑部的富集量（如图四所示）。▲图五：a）帕金森小鼠的建模和治疗示意图；b）转棒实验；c-e）水迷宫实验；f）脑脊液中的多巴胺含量；g）脑部神经元尼氏染色和免疫荧光检测TH及IBA-1表达。
我们通过两次尾静脉注射CSPQ@CM纳米颗粒治疗帕金森小鼠（如图五所示）。治疗之后的小鼠在转棒实验中，停留在转棒上的时间明显增加。在水迷宫实验中，游泳速度得到提升，能够快速找到逃生平台。在空间探索实验中，治疗组小鼠的记忆认知也得到明显改善，穿过逃生平台的次数明显增多。此外，我们利用Elisa检测不同组小鼠的脑脊液中多巴胺含量，发现经过治疗的小鼠脑脊液中多巴胺含量增加。脑部组织的尼氏染色、TH、IBA-1免疫荧光显示，CSPQ@CM纳米颗粒可以显著改善帕金森小鼠脑部微环境，提高帕金森病的治疗效果。▲图六：a）小鼠脑部免疫荧光标记M2型小胶质细胞标志物CD206的表达与FITC标记的CSPQ@CM纳米颗粒；b）流式细胞分析脑部小胶质细胞的极化（M1：CD86，M2：CD206）；c-d）ICP-MS检测经帕金森小鼠尾静脉注射CSPQ@CM纳米颗粒后，其体内的Cu2+离子分布变化。
为了进一步证明CSPQ@CM纳米颗粒对体内小胶质细胞的调控作用，我们利用FITC标记细胞膜包裹的CSPQ纳米颗粒，并采用聚焦超声辅助递送CSPQ@CM纳米颗粒至脑部（图六）。通过CD206的免疫荧光与FITC的荧光显示，CSPQ@CM纳米颗粒可以将小胶质细胞极化为保护神经的M2表型，并在流式细胞分析中得到进一步验证。我们在进行完水迷宫实验之后，收集不同组小鼠的主要器官（心脏，肝脏，脾脏，肺，肾，脑，血液），通过ICP-MS定量分析各脏器中铜含量的变化。结果显示聚焦超声可以显著提高脑部CSPQ@CM纳米颗粒的含量，治疗后不同组小鼠的主要器官中铜的含量相似，随着时间延长，CSPQ@CM纳米颗粒可以通过肝脏和肾脏清除，最终恢复到健康小鼠的水平。我们巧妙地制备了具有多种类酶活性的超小靶向纳米颗粒，通过高效清除ROS将小胶质细胞极化为对神经具有保护作用的M2表型，抑制炎症反应。同时利用细胞膜上的VCAM-1靶向小胶质细胞上的整合素α4β1，增加小胶质细胞对CSPQ@CM的吞噬，减少外排。此外，我们借助聚焦超声打开血脑屏障提高纳米颗粒在脑部的递送效率。通过这些协同策略，我们大大提高了帕金森疾病的治疗效果。本工作为治疗帕金森疾病及其它神经退行性疾病提供了新思路。