RAS癌基因突变是人类癌症中最常见的激活突变，发生在30%的人类肿瘤中。尽管是最早发现的癌基因之一，但三十年的努力一直未能识别出临床上可行的KRAS蛋白抑制剂，主要有两个原因：(1)KRAS以皮摩尔亲和力与GDP和GTP结合，严重阻碍了开发核苷酸竞争抑制剂的努力；(2)KRAS蛋白缺乏其它深表面疏水口袋，阻碍了寻找高亲和力变构抑制剂的努力[1][2][3]。
事情在2013年出现了重大突破，Shokat等[4]报告了一种旨在克服这些挑战的新策略，该策略使用共价抑制剂来靶向KRASG12C的活性半胱氨酸。野生KRAS与GDP结合的晶体结构图如下图3左图所示[5]。结晶学研究表明，在效应因子结合的Switch-II区域的下面形成了一个新的口袋，值得注意的是，突变体cys12位于与效应因子相互作用有关的核苷酸口袋和切换区附近（如下图1右图所示），基于二硫化物的片段筛选法在GDP结合状态下利用完整蛋白质质谱法对有480个系链化合物的文库进行了筛选，得到了片段6H05和2E07，且两个片段化合物未检测到与含有3个天然半胱氨酸残基的野生型K-RAS的反应。
图1. 野生型KRAS(左)与KRASG12C(右)GDP结合示意图 选取最优片段6H05进行构效关系研究，得到了最高活性化学物(6)，结合模式如右图所示（如下图2左所示），化合物6不结合在核苷酸口袋中，而是从Cys12延伸到主要由Switch-II组成的相邻口袋中。这种完全形成的口袋在RAS的其他已发表的结构中并不明显，尽管在某些情况下可以看到凹槽，以前的研究表明这个区域存在变构位点。将复合结合区称为Switch-II口袋(S-IIP) [4]。
图2. 构效关系研究图(左)；化合物6(青色)与GDP(灰色)以及Ca2+(绿色)结合的共晶结构示意图 (右) S-IIP位于RAS的中心β-折叠与α2-(Switch-II)和α3-螺旋之间，明确的电子密度显示了化合物6在S-IIP内部的位置，并证实了6与Cys12之间的二硫键（如下图3左所示）。6的疏水二氯苯基形成几个疏水接触。Glu99和Gly60形成直接氢键至6（如下图3右所示）。而Switch-II对形成S-IIP有明显的重排作用，Switch-I的构象没有从GDP结合状态改变[4]。
图3. 化合物6电子云密度图(左)；S-IIP的表面表示在化合物左右，显示氢键(黄线)。指示残基与6发生疏水接触(右) Shokat等没有继续使用基于二硫化物的化合物，而是转向了碳基亲电剂、丙烯酰胺和乙烯基磺酰胺，得到了高效的丙烯酰胺类化合物，其中化合物12活性很好，如下图6所示。同时又证明了化合物12不和野生型KRAS的半胱氨酸反应。覆盖多个共晶结构表明，化合物通过口袋遵循类似的轨迹，并将官能团投射到(o-)和(p-)子口袋中。尽管末端苯环上有相当大的差异，但这些化合物满足相似的疏水相互作用，支持S-IIP的这一区域的关键作用(如下图4所示) [4]。
图4. 10 mM的化合物24小时后的加合物形成(左)；用GDP结合的K-Ras(G12C)覆盖8，9和11的共晶结构(右) EDTA对核苷酸交换的催化作用表明，虽然化合物可能会微妙地影响金属结合，导致核苷酸亲和力的变化，但即使在S-IIP被占据的情况下，Mg2+也不能被排除。结构分析还预测，交换因子SOS的功能可能会受到与S-IIP结合的影响。用化合物8或12阻断SOS催化的核苷酸交换处理K-RAS(G12C)，如上所述，这些化合物不会损害EDTA催化的GDP交换，具体结果如下图5所示[4]。
图5. SOS催化的全长K-RAS(G12C)的核苷酸交换单独(a)，或用8(b)或12(c)标记的KRASG12C；(a)a-c.e的图式表示；(e)a-c图的半衰期 接着用免疫共沉淀法发现了化合物12将破坏RAS的GTP状态的构象，并损害与效应因子(如Raf)的相互作用。在一小部分基因表型的肺癌细胞系中研究了化合物12的作用。如预期的那样，与没有G12C突变的组(H1437、H1299和A549)相比，含有G12C突变的细胞系(H1792、H358、H23和CALU-1)在处理后显示出存活率降低和凋亡增加，如下图6(左)图所示。高敏感的H1792细胞显示低水平的K-RASGTP，与抑制剂与K-RAS GDP的优先结合一致，如下图6(中)图所示。它们是高度依赖K-RAS的如下图6(右)图所示。值得注意的是，缺乏G12C的K-RAS依赖性(A549)和非依赖性(H1299)细胞株对化合物12不敏感。化合物12在H1792细胞中的半数有效浓度(EC50)为0.32±0.01 μM[4]。
图6. 肺癌细胞对抑制剂的敏感性、K-RasGTP水平及对K-Ras的依赖性。相对于DMSO治疗72h后的存活率百分比(左)；谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记的RBD(C-Raf的RAS结合域)与裂解液孵育测定K-RAS GTP水平(中)；转染KRAS siRNA 72h后评价细胞存活率(右) 总体而言，细胞数据为S-IIP结合复合物在K-RASG12C驱动的癌症中的基因型特异性使用提供了概念验证。 Matthew P. Patricelli等[6]在化合物12的基础上继续探索，发现化合物12在含有KRASG12C突变的NCI-H358(H358)细胞中没有表现出实质性的KRASG12C共结合，即使在100 μmol/L化合物处理6小时后也没有表现出明显的KRAS 共结合。为了解决化合物12缺乏细胞活性的可能原因，需要更有效的Switch II口袋抑制剂，进行了基于迭代结构的共价KRASG12C靶向试剂的设计，并测试了它们对纯化的重组KRASG12C的活性以及它们在细胞中结合KRAS G12C的能力。ARS-853，给出了很大的希望，如下图7所示。
图7. 化合物12的构效改进 在生化测定中，ARS-853与KRASG12C的结合速率常数为76M-1s-1，比化合物12提高了600多倍，细胞结合IC50在6小时为1.6 μmol/L。在GDP存在下，配体结合的KRASG12C的高分辨晶体结构将ARS-853的结合位点确定为前面描述的开关II口袋。在该结构中，ARS853共价连接到C12上，并延伸到位于KRAS的中心β-折叠与α2和α3螺旋之间的Switch II口袋区域。相对于其他已发表的开关II结合化合物的结构，ARS853诱导α2螺旋的旋转，伴随着M72的位移，以适应不同疏水口袋中的配体。这个疏水口袋被ARS-853的芳环占据，氯和甲基环丙基取代基提供了紧密的范德华接触，而酚羟基与D69形成了氢键。ARS-853丙烯酰胺的羰基与保守的K16和一个与通常的镁离子配位的水分子形成氢键，同时占据与KRAS的GTP结合形式的末端磷酸相似的位置。总体而言，该结构的多个特征表明，ARS-853结合的KRASG12C代表KRAS的非活性状态。具体如下图8所示[6]。
图8. H358细胞处理6h后胰蛋白酶消化的KRASG12C信号强度和LC/MS-MS分析(左)；与KRASG12C结合的ARS-853的晶体结构突出了开关II口袋中的关键氢键和疏水相互作用(右) Matthew R. Janes等[6]进一步通过实验说明了ARS-853抑制KRASG12C癌蛋白在细胞内的功能，ARS-853细胞参与需要KRAS G12C癌蛋白上的核苷酸快速循环，KRAS G12C GTP水平受上游信号因子调控。 尽管获得了以上的突破，揭示以前未知的RAS结合口袋，研究者们也开展了大量的筛选试验，但它们只导致了有限的证明，同时都严重缺乏对靶向作用机制的令人信服的体内反应的证明[7][8]。Matthew R. Janes等[9]基于结构的药物设计，继续提高突变导向和KRAS特异性抑制剂的效力和类药物特性。研究发现ARS-853系列化合物的主要缺点是血浆代谢稳定性短(t1/2<20min)和小鼠口服生物利用度差(F<2%)，使其不能用于进一步的体内研究。有限的结构活性关系也限制了ARS-853系列的进一步效力改进。将重点转移到设计结构上不同的支架上，这些支架适当地定位丙烯酰胺的构象和轨迹，并允许最佳的疏水结合部分在S-IIP中的适当放置。我们假设ARS-853系列的柔性2-氨基-1-(π-哌嗪-1-基)乙烷-1-酮连接子可以缩短并被更刚性的双环支架取代，并适合由之前报道的ARS-853共晶结构重新封装的S-II和A3螺旋之间的空闲区域[6]。经过广泛的支架优化，我们确定喹唑啉核心是一种多功能支架，可以克服ARS-853的SAR限制，并具有更好的类药物特性。如下图9所示。
图9. ARS-853的支架结构优化研究 这一进展导致了基于喹唑啉的系列，并在对支架周围的取代基进行系统优化之后，导致具有良好ADME/PK以及KRAS共价结合活性的显著改善，如下图10所示[9]。
图10. G12C-TE与喹唑啉核7位和8位取代基相关的生化速率常数的构效研究 继续合成了几个喹唑啉系列活性较高的化合物，最引人关注的是化合物ARS-1620，它含有一个氟苯酚疏水结合部分，具有轴向手性，表现了S-阿托品对KRAS-12半胱氨酸的异构体反应性(如下图11所示) [9]。
图11. ARS-1620化学结构 ARS-1620与KRASG12C结合的共晶结构显示了从最初的S-IIP KRASG12C抑制剂到Cys-12的独特结合模式和结合轨迹，并揭示了与His-95额外的关键相互作用的获得，从而获得了比ARS-853系列化合物更刚性、更有利的共价反应构象(如下图12、13所示) [9]。
图12. ARS-1620(黄金)和GDP结合的KRASG12C共晶结构，位置为开关1(蓝色)、开关2(粉色)和诱导开关2口袋(S-IIP)区域；从共晶结构看ARS-1620与KRASG12C的结合方式(右)；
图13. ARS-1620(金色)和ARS-853(绿色)的结合模式和关键相互作用的比较 在生化实验中，ARS-1620共价修饰KRASG12C的观察速率比ARS-853提高了10倍，证明了ARS-1620对KRAS的修饰效力比以前的化合物有了明显的提高。ARS-1620优先与KRASG12C的GDP结合状态作用，缺乏对野生型(WT)-KRAS蛋白的任何残基的可检测到的反应性。此外，与ARS-1620共价结合的KRAS G12C缺乏SOS和EDTA介导的核苷酸交换能力。同时在细胞层面证实了ARS-1620的抑制活性，Pan-RAS中对KRASG12C的选择性[9]。
共价抑制剂的一个主要风险是可能与非靶蛋白发生非特异性反应。ATP口袋附近有200个带有反应性半胱氨酸的激酶[10]，同样地延伸到含有反应性半胱氨酸的非激酶蛋白[11]，如果被靶向，可能会产生不必要的特异性毒性。为了更好地定义ARS-1620可能的脱靶易感性和特异性，使用无偏见的化学蛋白质组筛选来评估细胞内的共价反应活性，分辨率覆盖3012个注释蛋白质的8501个半胱氨酸残基，最终证实了ARS-1620 靶点专一性[9]。
ARS-1620在小鼠体内表现出极好的口服生物利用度和足够的血液稳定性，如下图14(左)所示，使得可以定量测量体内G12C靶点占有率。目前仍不清楚ARS-1620是否能够满足足够的共价动力学和药代动力学特性，以使S-IIP G12C靶向方法在体内成功。为了说明ARS-1620是否具有体内靶点占有率的能力，在已建立的携带KRAS p.G12C的异种皮下移植模型中口服了ARS-1620。在单次口服剂量或连续5次每日剂量后，ARS-1620产生的平均肿瘤峰值浓度分别为1.5 μM (50 mg/kg)和6.5 μM(200 mg/kg)，这使得KRAS G12C靶点占据显著(≥70% G12C-TE在200 mg/kg)超过24小时，如下图14(右)所示。在这些暴露下，ARS-1620提供了显著的G12C目标占有率(75%至90%G12C-TE)以及RAS-GTP和下游信号抑制[9]。
图14. ARS-1620的生化、细胞G12C-TE和药物性质综述(左)；MIA-PaCa2异种移植瘤单次(qd*1)或连续5天(每天qd*5)口服G12C-TE和ARS-1620(μM)暴露的药效学(PD)/PK评估(每组4例) 接下来，通过动物模型试验证明了目标占有率能转化为体内的抗肿瘤活性。如下图15所示[9]。
图15. ARS-1620或R-ATRO-异构体在MIA-PaCa2(p.G12C)或H441(p.G12V)皮下移植瘤(每组8只小鼠)中的抗肿瘤作用(左)；G12C-TE及每日治疗3周对肿瘤RAS活性的影响(右) 对KRAS依赖性的系统评估揭示了体外和体内肿瘤模型对KRAS抑制的不同敏感性，也体现了3D-椭球体系统能很好的预测体内抗肿瘤反应活性。如下图16所示[9]。
图16. KRAS依赖性的体外和体内肿瘤模型系统评估
最后在PDX肿瘤模型中证明了ARS-1620有效和选择性的抗肿瘤活性，如下图17、18所示。值得注意的是PDX1868含有EGFR T790M、L858R驱动突变，PDX0170在PMS2，MSH2，MSH6和APC中存在Lynch综合征突变。在所有采用的肿瘤模型中，ARS-1620在整个3周的治疗期间耐受性良好。此外，在CD-1小鼠身上没有观察到ARS-1620的临床症状或毒性，即使在7天内每天口服剂量高达1000毫克/公斤。在400 mg/kg以上，ARS-1620抑制了PK饱和度，因此在细胞系和PDX来源的模型中没有进一步增强抗肿瘤效果[9]。
图17. 携带KRAS p.G12C(n=4)，p.G12D(n=1，PDX1168)或WT等位基因的已建立的患者源性肿瘤移植(PDX)治疗3周后肿瘤体积的百分比变化
图18. 对具有代表性的pG12C PDX肿瘤在治疗3周后(最后一次给药后1小时)对p-ERK、p-S6和p-AKT进行IHC评估 总体而言，ARS-1620作为单一药物在NSCLC模型中广泛有效的体内证据提供了概念证明，即相当大一部分p.G12C KRAS突变的患者可能受益于KRAS G12C导向的治疗。Matthew R. Janes等对于ARS-1620研究提供了第一个体内证据，证明S-IIP靶向治疗方法可能是治疗KRAS p.G12C突变癌症患者的一种有前途的治疗策略。 下篇：AMG510高歌猛进
经过大量的优化工作，Shokat小组确定的早期HITS被MatthewR. Janes等修改，以提供一种适合体内应用的化合物，ARS-1620。早在Shokat实验室最初披露研究成果之前，Amgen公司已经开始确定KRAS G12C的共价抑制剂的研究，利用Carmot的技术平台得到了化合物1，如下图1所示[12-15]。
化合物1与GDP-KRAS G12C的共结晶揭示了化合物1相对于ARS-1620采用了一种新的结合模式，1的四氢异喹啉环占据了KRAS表面先前未被开发的隐袋，该口袋由组氨酸-95侧链的旋转揭开，并包含部分H95、Y96和Q99。如下图1所示尽管与ARS-1620相比，这个隐蔽口袋的接合导致细胞效力提高了数倍，但化合物1在啮齿动物模型系统中存在非常高的清除率和低的口服生物利用度，使其不适合在体内使用。寻求利用H95/Y96/Q99隐蔽口袋的替代方法，这种口袋可能会提供具有更好药用性能的线索[15]。
图1. ARS-1620(蓝色)与化合物1 (粉红色)的GDP-KRASG12C结合模式的比较 同时ARS-1620虽然该加合物在体外和体内对KRAS G12C突变的肿瘤显示出良好的抗增殖活性，但为了得到治疗上有用的分子，细胞效力的进一步提高似乎是必要的。
化合物1和ARS-1620的结合模式的叠加表明，取代ARS-1620的喹唑啉酮氮(N1)可能提供一种进入H95隐袋的替代手段，从而产生新的、增强效力的KRAS G12C抑制剂[15]。
图2. 化合物1和ARS-1620的结合模式的叠加概念图 制备了一系列酞嗪类似物来验证假设，其中酞嗪核心(X=N，Y=C)的C4位置(Y)被一系列芳基取代。测量了SOS1催化的GDP/GTP交换的抑制程度和下游ERK磷酸化信号的降低程度。研究发现C4(2)的苯基取代导致的效价比ARS-1620低约10倍(IC50=20.1 µM)，在p-ERK细胞实验中，效价比ARS-1620低20倍(IC50=58 µM)，如下图3所示[15]。
图3. 被设计接触隐袋的杂化支链化合物的生化和细胞活性 化合物2与GDP-KRAS G12C的共结晶证实了化合物2采用了类似于ARS-1620的结合模式，但新引入的C4苯基取代基占据了设计的H95/Y96/Q99隐袋，如下图4a所示。然而，C4苯基未能与隐袋残基(例如Y96)进行许多非共价接触，这促使研究进一步的苯环取代是否会与隐袋残基产生额外的接触，从而提高效力。在2的苯环上添加了一系列越来越大的邻位取代基(见上图化合物3-8)。化合物8被证明是最优的，然而，它显示了与ARS-1620相当的生化和细胞IC50值。为了进一步提高效力，还尝试了改变化合物8的酞嗪核心的效果。值得注意的是，与8相比，喹唑啉酮9在生化和细胞效力方面有显著的改善，所得到的化合物在体外试验中的效力是ARS-1620的~3-9倍。化合物9与GDP-KRAS G12C的共结晶证实了9采用了异丙基苯基与隐袋的Y96、H95和Q99残基紧密接触的结合模式，以及异丙基苯环和酞嗪环几乎正交取向的结合模式，如下图4b所示[15]。
图4.化合物2和9KRAS G12C的X射线晶体学研究 同时通过手性色谱分离R-和S-阿托品证实(R)-9的效力明显高于相应的(S)-9阿托品，如下图5所示。虽然(R)-9被证明是KRAS G12C信号的一种特别有效的抑制剂(p-ERKIC50=0.130 µM)，但GDP-KRAS G12C共晶结构提出了几个进一步优化的前景：(1)哌嗪C2位的取代似乎提供了通过与C12、E62和Y96更多接触来增强活性的机会，以及(2) (R)-9的氟酚“尾”的取代似乎提供了与亲脂残基形成更广泛接触的机会。此外，尽管(R)-9的药效前景看好，但PK研究显示在BALB/c小鼠中没有可测量的口服生物利用度。较低的膜通透性和相对较差的水溶性被认为是可能的致病因素。因此，C2和C7修饰也被视为调节(R)-9的生物药学特性以提高未来类似物生物利用度的潜在机会，如下图5所示[15]。
图5.优化(R)-9的哌嗪取代基(R2)和亲脂性“尾部”(R1)区域提高效力和生物利用度 对(R)-9进行修饰，用更大的基团取代了它的C7氟酚部分，这些基团旨在与“尾部”子袋中的残基进行额外的接触。在继续使用ERK磷酸化实验作为主要筛选的同时，也使用KRAS p.G12C(MIA Paca-2)和KRAS p.G12S(A549)细胞筛选以确认生长抑制活性仅针对p.G12C突变的细胞。萘酚(10)和吲唑(11)取代物确实在ERK磷酸化和活性测定中显示出增强的活性，但是这些类似物继续显示出较差的水溶性、低的MDCK渗透性，如上图5所示[15]。
为了提高MDCK的通透性，研究了去掉(R)-9中的酚类部分得到氟苯基(12)的效果发现这种修饰在p-ERK和活性测定中都没有活性损失，而MDCK通透性增加了3倍多。在引入哌嗪C2-甲基取代基的相关类似物中也保留了良好的MDCK渗透性，甲基哌嗪(13)不仅进一步改善了细胞活性(p-ERKIC50=47 nM)，而且还显示了可测量的小鼠口服生物利用度(12%)。用更大的亲脂取代基(例如邻氯苯基(14)或邻三氟苯基(15))取代13的氟苯基尾部的尝试导致细胞活性和MDCK通透性降低。同样，虽然在13中重新引入酚类部分(以提供氟苯酚(16))对细胞活性的影响很小，但膜的通透性显著降低[4]。
由于(R)-9和(R)-16的酚性官能团成为这些类似物降低MDCK渗透性的关键因素，研究一种替代策略来减轻这种不利影响。假设膜扩散过程中苯酚的去溶剂化增加了膜渗透的能量成本，研究喹唑啉酮环C8位的氮掺杂是否可以通过提供一个内部氢键受体来满足膜渗透过程中相邻的酚类供体，从而提高MDCK的渗透性。结果氮喹唑啉酮(17)和(18)与它们的非氮杂同系物(9和16)相比，不仅表现出显著的MDCK通透性，而且还显著改善了水的溶解性。化合物17的口服生物利用度仍令人失望(1.3%)，而氮喹唑啉酮18的口服生物利用度显著提高(33%)，细胞活性显著增强(p-ERK IC50=44 nM；MIA Paca-2活性IC50=5 nM)。综合考虑MDCK的渗透性、生物利用度、体内清除率、效力、代谢稳定性、水的溶解性决定对18进行进一步优化[15]。
随后的研究发现化合物18的一个新挑战，虽然异丙基苯基-喹唑啉酮联芳键键的空间拥挤环境极大地限制了旋转，导致了可分离的阿托异构体的产生，但它并没有完全限制围绕这个键的旋转。异构体在25°C下发生缓慢的相互转化，半衰期为8天，相互转化自由能垒为26kcal/mol，这将极大地使(R)-18作为纯物质的发展复杂化，如下图6所示[15]。
图6.化合物18阿托异构体在25°C时构型不稳定 启动三种策略来识别具有阿托异构体构型特性的先导化合物，以适合药物开发需要。这些策略包括：(1)提高阿托品异构体相互转化的能量势垒，以形成单一的纯阿托品；(2)降低相互转化势垒，以形成自由相互转化的阿托混合物；或(3)使隐袋取代基对称，以避免手性轴的产生。经过研究(R)-24成为随后在异种移植模型中进行药效学和有效性测试的主要候选药物[15]。
图7.阿托异构体稳定性和KRASG12C活性与隐袋芳烃特性和取代方式的关系
检测(R)-24对体内KRAS信号转导的影响，将(R)-24口服给裸鼠皮下接种MIA-Paca-2T2人肿瘤细胞(纯合KRASp.G12C)，观察(R)-24对KRAS信号转导的影响。血清和肿瘤样本在给药2小时后收集，显示(R)-24在不同剂量(10-100 mg/kg)之间呈剂量比例暴露，在低剂量(30 mg/kg)时最大限度地抑制了下游ERK的磷酸化(图8a)。30 mg/kg剂量组的游离血浆和总肿瘤暴露(分别为3和11 nM)明显低于体外p-ERK IC50(28 nM；孵育2小时后测定)，这提供了一个初步的迹象，表明KRASG12C的共价失活可能具有持久的下游效应，即使在没有循环药物的情况下也是如此。随后在裸鼠移植瘤有效性研究中使用相同的方法对(R)-24进行了分析。(R)-24在肿瘤建立后两周内每天口服一次(10-100毫克/公斤)，在30毫克/公斤剂量下完全抑制肿瘤生长，在60毫克/公斤剂量下引起肿瘤消退(图8b)。(R)-24在裸鼠体内的时程PK研究(30mg/kg，PO)再次证实了早期PK/PD研究的结果，表明体外2h p-ERK IC50的体外处理<2-3h足以实现肿瘤生长停滞(图8c) [15]。
图8.(R)-24动物试验结果 随后研究发现(R)-24晶型与早期研究中使用的非晶型相比，口服生物利用度显著降低(4-12%)时，这削弱了在未来研究中实现适当血浆暴露的能力。由于生物利用度降低的同时，生物悬浮介质中的溶解度也大幅降低，因此优先确定具有优异水溶性的(R)-24类似物。采用两种策略：(1)通过改变喹唑啉酮C6卤素取代基降低(R)-24的亲脂性，(2)通过在隐袋环中引入额外的氮原子来增加(R)-24的极性表面积，如下图9所示[15]。
图9.(R)-24的生物制药优化显著提高了生物利用度 最初集中在将氮原子加入到神秘的口袋环中。用氮原子(见化合物34和35)取代异丙基或甲基取代基附近的碳原子显著提高了水的溶解性，而不会明显改变KRAS的活性。然而，这种替代也大大降低了MDCK的渗透性，提供了没有可测量的口服生物利用度的分子(BALB/c小鼠)。虽然双氮取代(36)同样进一步提高了水的溶解性，但所得到的嘧啶类似物同样具有低渗透性，并且没有可测量的口服生物利用度。接下来研究了降低喹唑啉酮C6取代基的亲脂性是否可以在保持细胞活性的同时提高水的溶解性。虽然用氟取代基(R)-24的C6氯取代基(化合物37)导致细胞分析中的活性略有下降(例如，p-ERK IC50=90 nm)，但这一改变也导致水溶解度略有增加(~3倍)，并且对膜的通透性没有不利影响。但(R)-37没有显示出任何可测量的口服生物利用度(%F<0.5)。然而，将C6氟取代与隐蔽口袋芳烃环(化合物38-40)中的氮掺入相结合，克服了之前类似物一贯的低生物利用度。虽然氮原子的加入再次导致所有三种化合物的MDCK渗透率显著降低，但这一特性的结合显著提高了水的溶解度(在所有生物悬浮介质中均大于423µM)。从这些研究中，(R)-38成为突出的分子，在细胞分析中表现出良好的活性(p-ERK IC50=68 nm)，中等渗透性(PAB=6 µcm/s)，以及出色的口服生物利用度(晶态为22-40%)，如上图9所示[15]。
令人满意的是，(R)-38在裸鼠MIAPaca-2异种移植模型中口服(0.3100 mg/kg)时呈现剂量比例的血浆暴露，并在剂量≥10 mg/kg时显著抑制ERK磷酸化(图10a)。进一步研究(R)-38的PK/PD关系，在异种移植模型中进行了时程药效学研究(图10b)。研究支持了(R)-24和(R)-38的早期结果，表明虽然ERK磷酸化在给药后60-120分钟得到最大程度的抑制，但(R)-38血浆和肿瘤暴露在给药后30分钟达到峰值，到120分钟的时间点，循环中只有低浓度的(R)-38保持不变[15]。
图10.化合物(R)-38的P-ERK(a)剂量反应和(b)血浆和肿瘤暴露的时程(MSD) 由于药效学效应的鼓舞，在一项使用MIA Paca-2 T2(p.G12C)肿瘤细胞进行的小鼠异种移植疗效研究(R)-38。每天一次口服剂量(10-100 mg/kg)在10 mg/kg时肿瘤生长抑制率达86%，在≥30 mg/kg剂量下肿瘤消退显着(图11a)。这项研究的非结合血浆暴露(图11b)再次表明，考虑到共价抑制剂的作用机制，在没有持续药物暴露的情况下，可以实现持久的生长反应。在10 mg/kg剂量下，体外p-ERK IC50的血浆覆盖率仅维持1h，给药后8h循环游离浓度已降至1 nM以下。尽管如此，体外p-ERK IC50的1h覆盖足以使肿瘤生长接近停滞，而体外IC50覆盖仅2h(30 mg/kg剂量)就足以引起肿瘤的消退[15]。
图11.a.化合物(R)-38对MIA-Paca-2T2裸鼠移植瘤生长的影响(qd，PO剂量)。b.平均游离血浆浓度 对(R)-38进行了进一步的表征，以评估其作为可能的开发候选药物的潜力。与KRASG12C的共结晶揭示了(R)-38采用了类似于先前喹唑啉酮先导化合物的结合模式，(R)-38的喹唑啉酮核心占据了KRASSwitch II口袋，丙烯酰胺部分与C12形成了共价键，如下图13所示。(R)-38的(S)-甲基哌嗪环采用螺旋船构象，C2甲基取代基与C12和Y96紧密接触。关键的是，吡啶环的异丙基再次与Y96、H95和Q99紧密接触，很大程度上填满了H95残基的侧链旋转所揭示的隐蔽口袋，并有助于该分子的效力。同时也没有发现隐蔽口袋芳环的氮取代对强效R-阿托的构型稳定性产生不利影响，如下图14所示[15]。
图13. 化合物(R)-38与GDP-KRASG12C(青蓝)键合的X射线晶体结构
图14. 化合物(R)-38的额外体外和PK表征;(R)-38化合物结构 基于(R)-38令人信服的药理学特征及其显著的体内消退KRAS p.G12C突变肿瘤的能力、良好的生物药剂学特性以及在临床前毒理学模型中出色的耐受性，Amgen于2018年将(R)-38 (AMG 510)进行临床开发。目前AMG 510已经进行到临床三期，在之前的临床试验中已经显示出一定的临床潜力。
KRAS开发从不可成药的魔咒，到Shokat和Matthew R. Janes等科学家带来的曙光乍现，再到AMG-510的高歌猛进，经历了时光，更经历了时光里的一场场风风雨雨，但到此KRAS的开发并没有结束，未来是晴空万里还只是短暂的狂欢？
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